鴨疫里默桿菌表型相關(guān)基因在重慶、四川分離株中的分布及遺傳多樣性分析

高繼業(yè)，黎容紅，黃 偉，*，李德龍，陳思懷，陳學(xué)情

(1.西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶更尚科技有限公司，重慶 402460)

鴨疫里默桿菌感染(Riemerellaanatipestiferinfection)又稱鴨傳染性漿膜炎(infectious serositis)，是當(dāng)前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一，發(fā)生率和致死率最高可達(dá)75%以上，其病原為鴨疫里默桿菌(Riemerellaanatipestifer,R.anatipestifer)[1-11]。R.anatipestifer在我國至少有25個血清型，不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同時間流行的血清型存在較大差異，且各血清型間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)抗原物質(zhì)[6-11]。R.anatipestifer分布的廣泛性、血清型的多樣性、菌株間致病力的巨大差異性和不斷增強(qiáng)的耐藥性，給感染的防治工作帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，也對我國食品安全構(gòu)成了巨大威脅[8-11]。雖然R.anatipestifer全基因組序列的測序工作已經(jīng)完成，在GenBank登錄序列多達(dá)33個，但很多基因的功能還沒有被明確的注釋。盡管關(guān)于R.anatipestifer毒力因子的研究不斷增多，其中包括協(xié)同溶血素(CAMP)、血凝素(Hemaglutin，Hema)、外膜蛋白A(OmpA)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等，但其致病力發(fā)生差異的分子基礎(chǔ)和可能機(jī)制一直沒有得到明確的解釋[12-20]。

細(xì)菌的遺傳學(xué)因素在其致病力方面發(fā)揮著巨大的作用，主要包括：細(xì)菌對外環(huán)境信號的感受和應(yīng)答，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，毒力相關(guān)操縱子和調(diào)節(jié)子的組成，以及質(zhì)粒、毒力島等移動的遺傳學(xué)因子[21-22]。因此，某些特定基因的存在或表達(dá)必將決定細(xì)菌的某些生物表型，如毒力、耐藥性等，而從這些特定的基因或相關(guān)區(qū)域中找出特異的DNA片段具有重要價值，如幽門螺旋桿菌新的限制-修飾系統(tǒng)，沙門菌血清型特異性基因，奈瑟球菌屬病原特異性基因等，即使找出的這些基因片段的功能不清楚，但也可作為診斷的分子標(biāo)記[23-25]。為此，本研究以重慶、四川地區(qū)的R.anatipestifer流行菌株為研究對象，檢測部分生物表型相關(guān)基因在其基因組中的分布，分析其出現(xiàn)的頻率與保守性，將有助于探討R.anatipestifer感染致病的分子基礎(chǔ)，對闡明其致病力發(fā)生差異的分子基礎(chǔ)及可能機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒22株R.anatipestifer均分離自重慶、四川地區(qū)的(隱性)感染鴨或鵝，純化后經(jīng)生化試驗(yàn)、16S rRNA編碼基因序列測定和比對分析鑒定，由本研究室凍干保存(表1)。

表1 基因PCR檢測菌株

1.2 主要試劑胰蛋白胨大豆瓊脂(Trypticase Soy Agar，TSA)，OXOID公司產(chǎn)品；Goldview核酸染料、X-gal、IPTG、氨芐青霉素，重慶鼎國生物試劑有限公司產(chǎn)品；MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、TaKaRaTaqTM、DNA molecular weight marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 基因的選擇及引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[12，15，26-28]，并根據(jù)GenBank登錄的R.anatipestifer全基因組序列(表2)進(jìn)行分析，選取18個生物表型相關(guān)基因，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，對目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆測序分析，擴(kuò)增的基因及引物見表3。

表3 PCR檢測基因及引物序列和定位

1.4 PCR擴(kuò)增取目標(biāo)菌株的TSA新鮮培養(yǎng)物，參照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增基因及引物序列見表2,。采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2(5 mmol/L)2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、DNA模板2 μL、上下游引物(10 μmol)各1 μL、rTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，無菌ddH2O補(bǔ)至終體積25 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，按94℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 2 min循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min，4℃保持5 min。同時設(shè)不加模板的陰性對照。

表2 參考基因組信息

1.5 PCR產(chǎn)物純化及測序分析PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析、切膠回收、純化后送北京華大基因公司測序，采用DNAStar軟件對獲得的DNA序列進(jìn)行拼接和同源性的比較分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 RA、RS、RC菌株的全基因組序列測序分析取R.anatipestifer菌株RA、RS、RC對數(shù)生長期培養(yǎng)物，0.1%甲醛滅活后送杭州谷禾信息技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因組測序，使用CLC Genomics Workbench 6.5進(jìn)行二代數(shù)據(jù)的基因組拼接。將獲得的全基因組序列與GenBank登錄序列進(jìn)行遺傳多樣性比對分析(表2)。

2 結(jié)果

2.1R.anatipestifer生物表型相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在18個相關(guān)表型基因中，外膜蛋白A(OmpA)、類脂A生物合成?；D(zhuǎn)移酶(LipidA)、血凝素(Hema)、協(xié)同溶血素(CAMP)的編碼基因均能在22株R.anatipestifer中檢測到，表明這些基因在不同血清型菌株或不同地區(qū)的分離株中具有良好的保守性。另外，鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)及利用相關(guān)蛋白鐵依賴受體1(TbdR1)、鐵依賴受體2(TbdR2)、鐵依賴抑制子(DtxR)的編碼基因均能在22株R.anatipestifer中檢測到(表4)。從檢測結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，除細(xì)胞壁相關(guān)水解酶(CWAH)、嗜好模塊毒素(AMT)的編碼基因外，其他16個基因均能在鵝源分離株基因組中檢測到，而不具有致病性的菌株DX1、YC1、YC2均未能擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1(LuxR1)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子2(LuxR2)、熱休克蛋白(GroEL)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(TR)、AMT、的編碼基因。本研究還對18個生物表型基因在RA、RS、RC菌株全基因組序列中的分布進(jìn)行了檢索分析，結(jié)果顯示：除AMT的編碼基因未能在RS菌株中檢索到外，其他基因均能在3株菌中檢索到。

表4 18個表型基因在分離菌株中的PCR檢測結(jié)果

2.2 陽性擴(kuò)增基因的測序分析各基因的陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送北京華大基因工程公司和南京金斯瑞生物工程公司進(jìn)行測序。獲得的序列采用MegAlign程序(DNAStar 5.01)進(jìn)行遺傳多樣性比對分析(By Clustal W Method)。比對分析結(jié)果顯示，陽性擴(kuò)增基因序列與R.anatipestifer標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC1848相對應(yīng)的序列的同源性均在93%以上，其中雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(TCTR)、GroEL、LuxR1、插入素蛋白(IS1)、DtxR、TR、TbdR1、TbdR2的基因在陽性菌株中的同源性均在96%以上，而CAMP、Hema的編碼基因在陽性菌株中存在較強(qiáng)的遺傳多樣性(圖1)；對3株非致病菌株DX1、YC1、YC2的陽性擴(kuò)增基因進(jìn)行序列比對分析發(fā)現(xiàn)，OmpA、LipidA、Hema、TbdR1、TbdR2、DtxR的同源性均在95%以上。

圖1 協(xié)同溶血素和血凝素編碼基因序列的遺傳多樣性分析

2.3 RA、RS、RC菌株的全基因組序列分析本研究還對RA、RS、RC 3株菌的全基因組進(jìn)行了測序分析。分析結(jié)果顯示，RA、RC、RS的基因組大小分別為2 129 862，2 172 619，2 067 830 bp，G+C含量分別為35.03%，35.09%，34.96%，蛋白編碼基因數(shù)量分別為2 022，2 057，1 923，其中含多個抗生素耐受基因和毒力基因(表5)。獲得序列與GenBank登錄序列的進(jìn)行遺傳學(xué)多樣性分析結(jié)果顯示，血清Ⅰ型菌株RC與CH3、RA-CH-1處于同一分支，血清Ⅱ型菌株RA、RS與RA-GD、RA-SG、RA-YM屬于同一分支，雖與ATCC11845菌株處于同一遺傳節(jié)點(diǎn)，但遺傳關(guān)系的密切程度存在差異。另外，RA、RS與同為血清Ⅱ型的菌株RA-CH-2處于不同的遺傳節(jié)點(diǎn)上，其確切關(guān)系尚不清楚。

表5 RA、RS、RC菌株的全基因組特征

3 討論

3.1R.anatipestifer基因組存在遺傳多樣性R.anatipestifer早在1932年就被分離獲得，并于1997年被歸于黃桿菌科第5核糖體RNA總科[1-3]。盡管GenBank上登錄的R.anatipestifer全基因組序列已多達(dá)12個，但許多基因的功能都還沒有明確的注釋，其血清型、致病力等生物表型的多樣性一直沒有得到很好的解釋。本研究將國內(nèi)流行范圍最廣的血清Ⅰ、Ⅱ型菌株RA、RC、RS全基因組序列與GenBank登錄序列進(jìn)行了遺傳多樣性分析，分析結(jié)果表明：血清Ⅰ型菌株與血清Ⅱ型菌株分屬于不同的分支，且血清Ⅰ型菌株間遺傳關(guān)系非常接近，而血清Ⅱ型菌株間遺傳關(guān)系的密切程度存在較大差異(圖2)。結(jié)合生物表型相關(guān)基因的PCR檢測結(jié)果猜測，這可能與菌株間存在不同程度的基因缺失有關(guān)，且血清Ⅱ型菌株發(fā)生缺失的頻率顯著高于血清Ⅰ型菌株。另外還發(fā)現(xiàn)，除RA-CH-2外的所有血清Ⅱ型菌株均與ATCC11845處于同一遺傳節(jié)點(diǎn)，據(jù)此推測ATCC11845菌株可能屬于血清Ⅱ型。另外，R.anatipestifer基因組出現(xiàn)這種遺傳多樣性和遺傳學(xué)上相距甚遠(yuǎn)的可能原因有兩個：一是通過疾病過程本身的突變和選擇作用;二是優(yōu)勢血清型表型基因在R.anatipestifer群體中發(fā)生了水平傳遞或缺失。但無論是哪種情形，均可能存在一種與疾病相關(guān)的選擇作用，這種選擇作用將有利于增加那些遺傳上相距很遠(yuǎn)但能表達(dá)優(yōu)勢血清抗原的菌株的出現(xiàn)頻率與地理分布。

圖2 鴨疫里默桿菌全基因組的遺傳學(xué)多樣性分析

3.2R.anatipestifer弱/無毒株的侵襲力相關(guān)基因存在缺失病原菌突破感染宿主機(jī)體的防御機(jī)能，在宿主體內(nèi)的定居、繁殖及擴(kuò)散和蔓延的能力是構(gòu)成其侵襲力的主要因素，也是其毒力或致病性的重要組成部分。本研究對涉及R.anatipestifer在感染宿主體內(nèi)定居、繁殖及擴(kuò)散、蔓延的能力的相關(guān)蛋白的編碼基因進(jìn)行了PCR檢測和測序分析，主要包括DtxR、TbdR1、TbdR2、CAMP、Hema、GldJ、GroEL。其中DtxR、CAMP、Hema與R.anatipestifer在感染宿主體內(nèi)的鐵/血紅素代謝有關(guān)，GldJ被認(rèn)為與細(xì)菌的運(yùn)動密切相關(guān)，而作為真核生物熱休克蛋白類似物的GroEL是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)抗原，被認(rèn)為可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)病原體免受宿主吞噬細(xì)胞的惡劣環(huán)境的侵害，也被報道為多種感染中的有效免疫原[29-30]。分析結(jié)果顯示，DtxR、TbdR1、TbdR2、GroEL的編碼基因在陽性菌株中高度保守，同源性高達(dá)96%以上，而CAMP、Hema在陽性菌株中同源性存在較大差異，并形成3個相對獨(dú)立的分支；另外，GroEL基因進(jìn)在弱毒株MY、TL和無毒株DX1、YC1、YC2中呈陰性，GldJ基因在弱毒株MY、TL和無毒株DX1中呈陰性。據(jù)此推測，在感染宿主體內(nèi)遷移和抗吞噬相關(guān)基因的缺失可能是R.anatipestifer無毒或弱毒株與強(qiáng)毒株表型差異的原因之一。

3.3R.anatipestifer毒力因子間可能存在協(xié)同作用和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控依據(jù)報道，可將R.anatipestifer的毒力因子分為3種類型：一是分泌型毒力因子，即分泌系統(tǒng)分泌的毒力因子；二是細(xì)菌表面毒力因子，即菌體細(xì)胞表面組成成分，包括夾膜、菌毛、生物膜，以及錨定在細(xì)菌表面的大分子蛋白等；三是代謝調(diào)控型毒力元件，這些調(diào)控元件包括能量代謝調(diào)控子、應(yīng)激相關(guān)調(diào)控子、細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子、細(xì)菌單元與雙元調(diào)控系統(tǒng)、細(xì)菌毒力因子翻譯后修飾元件等[31]。在檢測的18個表型中，CAMP、Hema、AMT、CWAH屬于第1種類型，OmpA屬于第2種類型，Luxr1、Luxr2、TR、TCTR、IS1屬于第3種類型，而GAPDH存在于菌體細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中和細(xì)胞膜外表面，故同時屬于第1,2種類型。研究中發(fā)現(xiàn)，OmpA、CAMP幾乎存在于包含無毒株在內(nèi)的所有菌株中，且同源性高達(dá)95%以上，表明OmpA、CAMP為R.anatipestifer非必需毒力因子；而AMT，不僅在無毒或弱毒株中未被檢測到，部分強(qiáng)毒或中強(qiáng)毒株中也未被檢測到，其中包括RS菌株，表明R.anatipestifer可能存在可替代AMT的其他毒力因子。LuxR1、LuxR2是LuxR家族蛋白的重要成員，是細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中一類具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的受體蛋白，主要通過與靶基因的結(jié)合或解離，在轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出激活或抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，而TR、TCTR、IS1則是細(xì)菌基因組中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。盡管本研究還未能找到以上基因在R.anatipestifer致病性方面可能發(fā)揮作用的直接證據(jù)，但這些基因控制細(xì)菌毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、細(xì)菌生物膜的形成、質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移、色素的產(chǎn)生、細(xì)菌的運(yùn)動等是確信無疑的。根據(jù)以上結(jié)果可推測，R.anatipestifer毒力因子間可能存在協(xié)同作用過程，并受到復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其作用方式和調(diào)控機(jī)理還要期待在未來的研究中被一一揭示。

綜上所述，R.anatipestifer基因組存在遺傳多樣性，某些菌株在遺傳學(xué)上相距甚遠(yuǎn)，這可能與疾病過程本身的突變和選擇作用有關(guān)。這種突變和選擇作用導(dǎo)致某些優(yōu)勢血清型表型基因在R.anatipestifer群體中發(fā)生了水平傳遞或缺失，進(jìn)而有利于增加那些遺傳上相距很遠(yuǎn)但能表達(dá)優(yōu)勢血清抗原的菌株的出現(xiàn)頻率與地理分布。同時，R.anatipestifer毒力因子間可能存在協(xié)同作用過程和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，這使其致病的分子基礎(chǔ)及機(jī)制變得更加復(fù)雜，單一的基因功能研究對闡明R.anatipestifer感染致病過程和分子機(jī)制的意義將變得十分有限。