慢性冷應激對放牧西門塔爾母牛免疫功能、抗氧化功能及血清激素分泌的影響

陳 浩，敖日格樂，王純潔，斯木吉德，阿日查，張 劍，劉 波

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

牛肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白及富含微量元素等優(yōu)點，在人們所食用的肉產(chǎn)品中所占份額越來越高[1]。據(jù)統(tǒng)計，2017年我國人均牛肉消費量為5.8 kg/人，連續(xù)7年保持上升趨勢；牛肉市場供不應求，2018年我國牛肉進口量為106萬t，同比增長51.42%[2]。在這一形勢下，國家不斷加大標準化養(yǎng)殖推進力度[3]。但由于我國北方地區(qū)冬季低溫環(huán)境極易引起肉牛產(chǎn)生冷應激，導致肉牛生產(chǎn)性能及繁殖性能下降，發(fā)病率及死亡率增高，給我國北方肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，這嚴重的限制了我國肉牛產(chǎn)業(yè)的健康迅速發(fā)展[4-6]。

在低溫環(huán)境刺激下，處于冷應激狀態(tài)的動物機體啟動一系列非特異性的自身免疫反應緩解應激帶來的影響，這個過程會引起血液中一些生化指標的變化，并造成動物機體免疫功能及抗氧化功能的損傷[7-8]。近年來，對肉雞冷應激的研究表明，冷應激12 h時肉雞血清中IgA、IgG極顯著上升，并在試驗結束時(150 h)仍維持在較高水平[9]。楊莉等[10]通過比較冷應激對羊免疫功能的影響，結果表明冷應激后阿勒泰羊和湖羊血清IL-2和IL-4的濃度均呈下降趨勢。KAUSHIK等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冷應激可使 腦、心臟、腎臟的SOD活性顯著下降。有研究報道冷應激狀態(tài)蒙古牛血液中的T3、T4及ACTH濃度相較于非應激狀態(tài)下顯著升高[12]。

西門塔爾牛是乳肉兼用品種，原產(chǎn)于瑞士的阿爾卑斯山區(qū)，現(xiàn)已分布許多國家，成為世界上數(shù)量最多，分布最廣的乳肉兼用品種之一[13]。錫林郭勒草原位于我國內(nèi)蒙古自治區(qū)北部高寒地區(qū)，寒冷期長達7個月，極端低溫可至―42.4℃，該地區(qū)西門塔爾牛飼喂方式以粗放的放牧為主，因此在冬春兩季長時間遭受冷應激侵擾[12]。

目前，關于動物冷應激的研究較少，關于冷應激對放牧牛血液生化指標影響的研究報道更少。因此，本研究擬以放牧西門塔爾母牛為試驗群體，檢測試驗個體在冷應激與非應激狀態(tài)下的血液生化指標，探討冷應激對西門塔爾母牛免疫功能、抗氧化功能及血清激素分泌的影響，進一步了解冷應激對肉牛機體影響的生理機制，旨在為我國北方草原放牧肉牛冬季的保溫抗病及冷應激相關研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理以內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某天然草場提供的16 頭2～4歲，體質(zhì)量為(380±20)kg且健康狀況良好的放牧西門塔爾母牛作為試驗動物。試驗牛飼養(yǎng)管理方式為全年放牧，自由采食牧草和飲水。

1.2 試驗時間及地點在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某天然草場進行。試驗分為2 個階段進行：秋季(2017年9月28-30日)和冬季(2018年1月29-31日)。

1.3 環(huán)境溫濕度測定由于試驗是以在天然草場進行全年放牧的肉牛為研究對象，所以所測的環(huán)境指標均為自然環(huán)境下的溫度和相對濕度。試驗期間，測定每天8:00，14:00，20:00的天然放牧草場的溫度和相對濕度，并監(jiān)測記錄試驗當月的平均氣溫和相對濕度。

1.4 血樣采集在試驗期最后1 d清晨對每頭試驗牛進行頸靜脈采血。用非抗凝采血管采集10 mL血液，靜置0.5 h后3 000 r/min離心10 min，分離制備血清，置于-20℃冰箱中保存供血液生化指標的測定

1.5 血液指標測定血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、MDA、T-AOC、T3、T4、ACTH、GH、GC和TSH含量測定采用酶聯(lián)免疫分析法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定方法按照試劑盒說明書進行操作。血清GLU和BUN使用日立7600生化儀檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003對所有試驗數(shù)據(jù)進行初步整理后，使用SPSS 17.0中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性分析，結果用平均值±標準差方式表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 肉牛放牧草場試驗期溫濕度結果見表1，2和3。在各試驗階段中，秋季放牧草場的最低溫度為12.5℃，最低濕度為41%(表1)。冬季放牧草場的最低溫度為-23.5℃，最低濕度為35%(表2)。根據(jù)監(jiān)測結果發(fā)現(xiàn)，秋季放牧草場的月平均氣溫為13℃，濕度為42%，冬季放牧草場的月平均氣溫為17.5℃，平均相對濕度為34%(表3)。

表1 秋季自然放牧環(huán)境的溫濕度

表2 冬季自然放牧環(huán)境的溫濕度

表3 不同季節(jié)平均氣溫和濕度

2.2 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清免疫指標變化結果見表4。西門塔爾母牛遭受慢性冷應激后，血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4的濃度顯著下降(P<0.05)，與非應激狀態(tài)相比，IgM的濃度有下降的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清免疫指標測定結果

2.3 不同季節(jié)西門塔爾母牛的抗氧化指標變化結果見表5。慢性冷應激對西門塔爾母牛SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但由于低溫環(huán)境的刺激，冷應激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清MDA濃度顯著升高(P<0.05)，T-AOC濃度顯著降低(P<0.05)。

表5 不同季節(jié)西門塔爾母牛的抗氧化指標測定結果

2.4 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清激素分泌變化西門塔爾母牛在秋季和冬季血清激素分泌測定結果見表6。冷應激使西門塔爾母牛血清中T3、T4和GLU的濃度顯著升高(P<0.05)，GH、GC和ACTH的濃度顯著降低(P<0.05)，兩種應激狀態(tài)下TSH和BUN的濃度無明顯變化(P>0.05)。

表6 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清激素分泌測定結果

3 討 論

3.1 慢性冷應激對西門塔爾母牛免疫功能的影響細胞因子是由免疫細胞和一些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成、分泌的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，除了參與免疫調(diào)節(jié)外，細胞因子在腫瘤、免疫缺陷、自身免疫性疾病及組織代謝等方面也起到一定作用[14]。血清中免疫球蛋白和免疫細胞因子的濃度可以反映機體的免疫功能，它們在防止動物機體遭受病毒感染方面也發(fā)揮著重要作用[15]。IgA、IgM和IgG主要由動物脾臟和淋巴結中的漿細胞合成分泌，在機體特異性免疫中發(fā)揮重要作用[16]。IgG約占血清中總免疫球蛋白的75%，其在體液免疫中起到主要作用，可作為血清學診斷的抗體[17]。IgM在抗原刺激誘導體液免疫應答中最先產(chǎn)生。在機體早期防御中起著重要作用。血液中的免疫細胞因子濃度可以反映機體細胞免疫的狀態(tài)[18]。IL-2是一種細胞生長因子，可以調(diào)控動物免疫系統(tǒng)中白血球的細胞活性，同時參與抗體反應，其主要作用是增強巨噬細胞和T淋巴細胞活性[19]。IL-4主要功能是誘導B細胞成熟并刺激其產(chǎn)生免疫球蛋白，對于體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用[20]。井霞[21]研究發(fā)現(xiàn)，冷應激狀態(tài)下奶牛的免疫功能下降或遭到抑制；RYBAKINA等[22]報道冷暴露可使小鼠機體的體液免疫受到明顯的抑制。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，冷應激狀態(tài)下西門塔爾牛血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4含量顯著低于非應激狀態(tài)，表明冷應激抑制了免疫球蛋白的合成，導致西門塔爾母牛體液免疫功能受損。這可能是由于本試驗冬季試驗期間在1月份，試驗牛在草原上常年放牧，已遭受較長時間冷應激侵襲，長期冷應激刺激西門塔爾母牛機體生成多種血清免疫抑制因子，抑制了白細胞介素的產(chǎn)生，進而影響機體免疫球蛋白的合成，導致西門塔爾母牛免疫功能嚴重受損，IL-2的分泌水平對動物機體免疫球蛋白合成的抑制作用機制有待進行深入研究。

3.2 慢性冷應激對西門塔爾母?？寡趸δ艿挠绊懤鋺顟B(tài)下，機體的抗氧化平衡遭受破壞導致自由基大量產(chǎn)生，過量的氧自由基可誘導脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)生進而產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，導致脂質(zhì)過氧化作用增強，加劇機體遭受的氧化應激損傷[23]?？寡趸冈谇宄龣C體內(nèi)自由基及保護機體免受過氧化應激損傷方面發(fā)揮重要作用[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低可反映機體組織脂質(zhì)過氧化的程度，是代表細胞損傷的指標之一[25]；SOD是酶促反應體系中重要的酶，在機體內(nèi)的主要作用是清除超氧陰離子自由基進而防止細胞損傷，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，T-AOC是衡量機體總抗氧化能力高低的重要指標[26-27]。有研究報道，慢性冷應激顯著提高了蒙古牛血清中MDA含量[12]。孟祥坤等[28]通過研究慢性冷應激對西門塔爾犢牛的影響時，發(fā)現(xiàn)在-4.0℃日平均氣溫下，犢牛血清中MDA水平顯著升高，SOD活性顯著下降。有研究指出，大鼠在遭受冷應激初期，血清SOD活性升高，但持續(xù)遭受冷應激后，SOD活性下降[29]。本試驗研究結果表明，冷應激導致西門塔爾母牛血清中MDA含量顯著下降，T-AOC水平顯著提高，而SOD活性無顯著變化，表明冷應激對西門塔爾母?？寡趸δ茉斐闪擞绊?，SOD活性無顯著變化可能是由于試驗牛在初冬遭受冷應激時，由于機體的代償保護作用而升高，隨著冷應激持續(xù)時間的延長，SOD活性下降，恰好在本試驗冬季采樣期間SOD活性下降到非應激狀態(tài)水平，本試驗組將在今年冬季進行長期監(jiān)測冷應激狀態(tài)下肉牛抗氧化能力的變化，進而對本試驗中SOD活性結果的猜測進行驗證。

3.3 慢性冷應激對西門塔爾母牛血清激素分泌的影響當動物遭受冷應激侵擾時，其主要的生理反應是通過增加產(chǎn)熱以維持恒定的體溫[30]。甲狀腺激素是甲狀腺分泌的激素，主要包括T3和T4。T4是甲狀腺的主要分泌物，全部由甲狀腺細胞產(chǎn)生；大部分T3由T4脫碘轉變而成，其具有加強組織代謝，提高組織產(chǎn)熱量及促進糖類吸收等作用[31]。甲狀腺激素的合成和分泌受TSH的控制，其分泌過程與大腦皮層接受的外界刺激相關[32]。吳永魁[33]通過對仔豬進行冷應激處理后，發(fā)現(xiàn)血液中T3和T4含量均顯著升高[12-13]。白丹丹等[34]通過比較不同季節(jié)對三河牛血液生化指標的影響，研究發(fā)現(xiàn)冬季冷應激狀態(tài)下三河牛血清中T3和T4含量均顯著高于春季非應激狀態(tài)。另有研究報道，三河牛在遭受急性冷應激后，血清中T3和T4含量均顯著升高[35]。本試驗研究結果表明，冷應激狀態(tài)下西門塔爾母牛血液中T3和T4含量相對于非應激期均顯著升高，這與已有的研究報道一致，表明慢性冷應激通過激活HPT軸，提高了TSH分泌水平，進而導致T3和T4含量顯著升高，從而增加產(chǎn)熱以提高西門塔爾母牛對冬季草原低溫環(huán)境的抵抗力。但在本試驗研究中發(fā)現(xiàn)，冷應激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清中TSH含量與非應激狀態(tài)下并無顯著性差異，這可能是由于試驗牛血液中T3和T4含量升高到一定水平后，通過負反饋作用抑制了TSH的合成與分泌，其作用機制有待進一步深入研究。ACTH是腦垂體前葉分泌的激素，其主要作用是增強腎上腺皮質(zhì)合成并釋放GC，GC普遍存在于動物的大腦和垂體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)機體各種代謝以維持內(nèi)環(huán)境的恒定[36-37]。本試驗結果表明，冷應激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清中ACTH和GC的分泌水平顯著高于非應激狀態(tài)，說明西門塔爾母牛在遭受慢性冷應激侵襲時，HPA軸被激活，促進ACTH和GC的分泌，增強肝糖原異生為機體提供能量，進而提高機體對寒冷環(huán)境的適應。由于動物機體各組織器官活動所需能量大部分來自葡萄糖，因此血液中葡萄糖需要保持一定濃度以維持機體需要[38]。王金濤等[39]研究發(fā)現(xiàn)，冷應激狀態(tài)下雛雞血漿葡萄糖含量顯著升高。孟祥坤等[28]報道冷應激狀態(tài)下西門塔爾犢牛血糖水平顯著升高。梁鴻雁等[40]通過研究冷應激對荷斯坦奶牛的影響，得出了相同的結果。本試驗結果表明，在冬季低溫刺激下，西門塔爾母牛血清中葡萄糖含量顯著升高，這可能是西門塔爾母牛遭受冷應激后，皮質(zhì)酮水平升高進而促進蛋白質(zhì)分解，糖異生作用加強引起的結果，為機體增加產(chǎn)熱以對抗低溫環(huán)境。GH是腺垂體細胞分泌的一類肽類激素，其主要生理作用是促進機體生長發(fā)育，并能夠促進分化大多數(shù)免疫細胞[41]。本試驗研究結果表明，冷應激期西門塔爾母牛血清中GH水平顯著下降，GH的分泌受垂體的調(diào)節(jié)，可能是由于冷應激激活西門塔爾母牛機體HPT軸，導致其主要生理反應為增加機體產(chǎn)熱而非生長，因此GH的合成和釋放發(fā)生障礙。血清BUN水平可反映動物蛋白質(zhì)代謝狀況，蛋白代謝良好時其含量較低[42]。有研究報道冷應激導致肉牛糖代謝下降，進而促進氨基酸分解代謝產(chǎn)生大量尿素，從而血清中BUN含量增加[43]。本試驗研究結果表明，冷應激對西門塔爾母牛血清中尿素氮含量無顯著影響，可能是由于本試驗的冬季試驗期是在放牧肉牛遭受兩個月的冷應激后進行的，機體逐漸適應了低溫環(huán)境，蛋白的合成及分解都逐漸達到平衡，因此變化不顯著。冷應激對肉牛血清BUN含量的影響機理，還有待進行深入研究。冷應激對西門塔爾母牛能力代謝也造成了一定的影響。

內(nèi)蒙古草原冬季低溫刺激使西門塔爾母牛遭受了較大的應激損傷，冷應激狀態(tài)下的西門塔爾母牛血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、MDA及T-AOC濃度較非應激狀態(tài)均產(chǎn)生了顯著變化，表明冷應激顯著降低了西門塔爾母牛的免疫功能和抗氧化功能。冷應激激活了草原放牧西門塔爾母牛HPA系統(tǒng)，使機體T3及T4均分泌增多以增加產(chǎn)熱，從而提高西門塔爾母牛對寒冷環(huán)境的抵抗力和適應力。