凝血因子Ⅱ G20210A、Ⅴ G1691A及Ⅶ R353Q基因多態(tài)性與上海漢族人群急性腦梗死的相關(guān)性*

岳孟孟，于芳蘋，趙迎春**

(1.南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)內(nèi)科，上海 201600； 2.南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院 老年科，上海 201600)

急性腦梗死(acute cerebral infraction，ACI)是由腦組織缺血引起的一系列病理改變及神經(jīng)功能障礙性疾病[1]，目前認(rèn)為ACI是一種受環(huán)境與遺傳等多因素共同作用的疾病，凝血與抗凝系統(tǒng)失衡是其發(fā)生的重要原因。正常機(jī)體凝血與抗凝系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦失衡則可能引起血栓或出血[2]。研究表明，凝血因子Ⅱ(coagulation factor Ⅱ，F(xiàn)Ⅱ)G20210A多態(tài)性可導(dǎo)致血漿凝血酶原水平升高，促進(jìn)纖維蛋白聚合，加速血栓形成[3]；凝血因子Ⅴ(coagulation factor Ⅴ，F(xiàn)Ⅴ)G1691A突變可導(dǎo)致活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance，APCR)，APCR患者對(duì)活化的凝血因子Ⅴ(activated coagulation factor Ⅴ，F(xiàn)Ⅴa)的滅活作用減弱，從而導(dǎo)致機(jī)體的高凝狀態(tài)[4]；凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ，F(xiàn)Ⅶ)R353Q在啟動(dòng)外源性凝血途徑中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)Ⅶ不僅參與凝血的啟動(dòng)，還參與血管新生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化等過程，F(xiàn)ⅦR353Q突變的機(jī)體FⅦ水平明顯升高，這也是機(jī)體高凝狀態(tài)的原因之一[5-6]。由此看出FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態(tài)性在血栓相關(guān)性疾病中起到重要的作用。但由于FⅡG20210A、FⅤG1691A的低突變率與ACI之間的關(guān)系仍不明確，F(xiàn)ⅦR353Q的Q等位基因突變是保護(hù)性因素還是危險(xiǎn)性因素也存在爭(zhēng)議。因此，本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-ligase detection reaction, PCR-LDR)及多重連接酶檢測(cè)分型(multiple ligase detection reaction, Multiple LDR)技術(shù)分析上海漢族人群ACI人群FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態(tài)性的分布情況，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象、主要試劑與儀器

1.1.1研究對(duì)象 選取2018年1月—2019年6月神經(jīng)內(nèi)科住院的ACI確診的漢族患者作為ACI組，均行頭顱CT和(或)MRI檢查、且符合2018年中國急性缺血性腦卒中診療指南ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)；選取同期健康漢族人群作為對(duì)照組，2組研究對(duì)象均排除近期有顱腦損傷、腫瘤、手術(shù)、自身免疫性疾病及嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者。ACI組共納入患者180例，男性99例、女性81例，平均年齡(71.74±9.63)歲，ACI病因分型(trial of org in acute stroke treatment ，TOAST)分別為大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死(large-artery atherosclerosis, LAA)、小動(dòng)脈硬化性腦梗死或腔隙性腦梗死(small-artery occlusion，SAO)及心源性腦梗死(cardioembolism，CE)各有65例、84例及31例；對(duì)照組正常人150例，男73例、女77例，平均年齡(70.06±9.17)歲。2組被檢者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑和儀器 脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒(美國Omega)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物(上海生工)，PCR擴(kuò)增體系(50 μL)、Marker及Loading buffer(日本寶日)，焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)水(上海碧云天)，瓊脂糖(美國AMERSCO)，限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ(restriction endonucleaseHindⅢ，HindⅢ)、限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ(restriction endonucleaseMspⅠ，MspⅠ)、限制性核酸內(nèi)切酶MnlⅠ(restriction endonucleaseMnlⅠ，MnlⅠ)及Buffer Tango(美國ThermoFisher Scientific)，APCR試劑盒(美國Instrumentation )；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1一般資料收集 收集ACI組和對(duì)照組研究對(duì)象的臨床資料，包括年齡、性別、血糖、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白B、脂蛋白a、吸煙史、飲酒史、高血壓及糖尿病病史。

1.2.2DNA提取 分別抽取ACI組和對(duì)照組被檢者入院或體檢時(shí)的清晨空腹外周血2 mL，檸檬酸鈉抗凝，離心后下層血細(xì)胞用于DNA提取，上層血漿置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；使用DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照說明說嚴(yán)格進(jìn)行；采用分管光度計(jì)法測(cè)量DNA提取物的濃度及純度，并將提取的DNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)使用Primer5軟件，由上海生工生物公司合成(表1)。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：Prime STAR Max Premix(2×) 25 μL ，樣本基因組DNA 2 μL(100 ng)，上、下游引物各1 μL(10-12moL/L)，DEPC水定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃末次延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL和6×loading buffer 2 μL混合后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照。余PCR產(chǎn)物置于-20 ℃保存。

表1 基因位點(diǎn)引物Tab.1 Gene primer sequences

1.2.4酶切及電泳 取PCR產(chǎn)物10 μL、10×Buffer Tango2 μL、核酸內(nèi)切酶(FⅡ反應(yīng)體系加入HindⅢ，F(xiàn)Ⅴ反應(yīng)體系加人MnlⅠ，F(xiàn)Ⅶ反應(yīng)體系加入MspⅠ) 2 μL，定容至20 μL，置于37 ℃溫箱12 h；取酶切產(chǎn)物10 μL和6×loading buffer 2μL混合后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5多重連接酶檢測(cè)基因型 PCR產(chǎn)物使用Multiple LDR進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single neucleotide polymorphisms，SNP)分型，由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.6APCR測(cè)定 將保存于-80 ℃冰箱的血漿取出，進(jìn)行APCR測(cè)定，使用APCR試劑盒，結(jié)果以活化蛋白C比率(activated protein ratio，APC ratio)表示，通過計(jì)算加APC的血漿活化部分促凝血酶原激活(activated partial thromboplastin time，APTT)值與不加APC的血漿APTT值的比值得到，正常范圍為2.61～3.32，超出上限為APCR陽性[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

ACI組與對(duì)照組被檢者間FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明本研究被檢者為一遺傳平衡群體，具有群體代表性。

2.2 基線資料

ACI組患者的收縮壓、血糖水平、高血壓病、糖尿病及吸煙比例均高于對(duì)照組(P<0.05)，但高密度脂蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 ACI組與對(duì)照組研究對(duì)象基線資料的對(duì)比Tab.2 The comparison of basic data between the ACI group and the control group

2.3 PCR-RFLP及Multi-LDR分型

FⅡ 基因G20210A的PCR產(chǎn)物經(jīng)過HindⅢ酶切之后，瓊脂糖凝膠電泳僅顯示一條320 bp的單一條帶，提示ACI組和對(duì)照組無基因突變(圖1A)；Multi-LDR結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致，僅檢測(cè)出單峰GG基因型，G等位基因的LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度為97 bp(圖1B)。FⅤG1691A的PCR產(chǎn)物經(jīng)過MnlⅠ酶切之后顯示2種條帶：第1泳道為GA雜合型(353 bp、205 bp和148 bp)，第2、3泳道為GG純合突變型(353 bp)，ACI組及對(duì)照組研究對(duì)象均未檢測(cè)出AA純合突變基因型(圖2A)；Multi-LDR結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致，僅檢測(cè)出GG與GA基因型，未檢測(cè)出AA基因型，GG基因型純合子為單峰，GA基因型雜合子為雙峰，等位基因G的LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度為76 bp，等位基因A的LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度為74 bp(圖2B、2C)。FⅦR353Q的PCR產(chǎn)物經(jīng)過MspⅠ酶切之后顯示3種基因型：第1、2泳道為GA雜合突變型(291 bp、223 bp和68 bp)，第3泳道為AA野生型(291 bp)，第4泳道為GG純合突變型(223 bp和68 bp)(圖3A)；Multi-LDR結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致，RR及QQ基因型純合子為單峰，RQ基因型雜合子為雙峰，等位基因R的LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度為79 bp，等位基因Q的LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度為81 bp(圖3B、3C及3D)。

2.4 基因頻率及等位基因頻率

ACI組及對(duì)照組研究對(duì)象外周血FⅡG20210A未檢測(cè)到A等位基因的變異，F(xiàn)ⅤG1691A僅檢測(cè)到GA雜合變異型1例；ACI組與對(duì)照組相比FⅦR353Q基因型及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TOAST分型中SAO組與對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

注：A圖為HindⅢ酶切電泳結(jié)果，1、2、3及4為GG基因型電泳的泳道；B圖為GG基因型LDR結(jié)果(sz97.54、ht13143)。圖1 FⅡ 基因G20210A的HindⅢ酶切電泳和LDR結(jié)果Fig.1 FⅡ G20210A PCR products digested by HindⅢ in agarose gel electrophoresis and LDR

注：A為MnlⅠ酶切電泳結(jié)果，1為GA基因型電泳的泳道，2、3為GG基因型電泳的泳道；B圖為GG基因型LDR結(jié)果(sz76.27、ht13154)；C圖為GA基因型的LDR結(jié)果(sz74.38、ht5973，sz76.32、ht6470)。圖2 FⅤ G1691A的MnlⅠ酶切電泳結(jié)果LDR結(jié)果Fig.2 FⅤ G1691A PCR products digested by MnlⅠ in agarose gel electrophoresis and LDR

注：A圖為MspⅠ酶切電泳結(jié)果，1、2為RQ雜合突變型電泳的泳道，3為RR純合子電泳的泳道，4為QQ純合突變型電泳的泳道；B圖分別為RR基因型的LDR結(jié)果(sz79.55、ht10350)；C圖為RQ基因型的LDR結(jié)果(sz79.57、ht6361，sz81.36、ht5907)；D圖為QQ基因型的LDR結(jié)果(sz81.21、ht14916)。圖3 FⅦ R353Q的MspⅠ酶切電泳結(jié)果Fig.3 FⅦ R353Q PCR products digested by Msp Ⅰ in agarose gel electrophoresis

表3 FⅦ G1691A基因型及等位基因頻率比較Tab.3 FⅦ G1691A genotypes and allele frequencies between the ACI group and the control group

2.5 APCR

ACI組患者APCR陽性率高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

2.6 ACI危險(xiǎn)因素分析

將ACI組及對(duì)照組的多項(xiàng)基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果合并，進(jìn)行二分類賦值，將賦值結(jié)果納入二分類Logistic回歸分析中，進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析。結(jié)果顯示，吸煙、高血壓、低水平高密度脂蛋白、FⅦR353Q基因型及APCR是ACI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表4 ACI組及對(duì)照組被檢者APCR比較Tab.4 The comparison of APCR between the ACI group and the control group

表5 ACI的二分類Logistic回歸分析Tab.5 Binary Logistic regression analysis of ACI

3 討論

FⅡ基因位于11號(hào)染色體，G20210A突變是指FⅡ基因3′-非編碼區(qū)20210位點(diǎn)核苷酸鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，該位點(diǎn)突變可上調(diào)血漿中FⅡ增加，從而抑制纖溶過程，促進(jìn)血栓形成。一項(xiàng)關(guān)于缺血性腦卒中各亞型的蛋白標(biāo)志物的研究發(fā)現(xiàn)，纖溶、凝血與凋亡通路與所有亞型的腦梗死顯著相關(guān)，且FⅡ與纖溶酶原是LAA、SAO及CE等各型腦梗死的關(guān)鍵蛋白，F(xiàn)Ⅱ與纖溶酶原參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，血管內(nèi)皮受損及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成導(dǎo)致血管內(nèi)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)失調(diào)，血供減少或者中斷，與各種亞型腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)[8]。FⅤG1691A因其可以導(dǎo)致APCR而使機(jī)體產(chǎn)生高凝狀態(tài)，因此FⅤG1691A基因多態(tài)性及APCR可能是靜脈血栓性疾病的危險(xiǎn)因素。研究表明FⅤG1691A也與動(dòng)脈型缺血性疾病有關(guān)，Kita等[9]對(duì)野生型、突變雜合子及突變純合子雄性小鼠進(jìn)行腦梗死造模，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變的雜合子與純合子小鼠表現(xiàn)出較大的腦梗死體積與較低的生存率，這可能是由于FⅤG1691A突變導(dǎo)致機(jī)體的高凝狀態(tài)，加重了腦梗死小鼠病灶的缺血再灌注損傷，由此推測(cè)，F(xiàn)ⅤG1691A可能影響動(dòng)物腦梗死的進(jìn)程及其預(yù)后。

有研究發(fā)現(xiàn)FⅡ G20210A及FⅤ G1691A基因多態(tài)性存在地區(qū)和種族的差異，白人中的突變率較高，南歐較北歐高，而在亞洲及非洲較低[10]。本研究對(duì)ACI組及對(duì)照組研究對(duì)象基因分型結(jié)果顯示，2組均未發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A的突變個(gè)體；ACI組患者中發(fā)現(xiàn)1例FⅤG1691A的雜合突變個(gè)體，也就是說FⅡG20210A及FⅤG1691A在上海漢族人群中的突變率極低。這與以往研究結(jié)果相似，Ahmed等[11]對(duì)蘇丹180名子癇前期患者及180名健康對(duì)照者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未檢測(cè)到FⅡG20210A突變；同樣胡雪梅等[12]對(duì)中國維吾爾族178位深靜脈血栓患者及217位健康對(duì)照者進(jìn)行檢測(cè)，也未檢測(cè)到FⅡG20210A的突變，F(xiàn)ⅤG1691A突變率為2.18%；鄭紅等[13]對(duì)676例正常中國人及500例正常高加索人進(jìn)行FⅡG20210A及FⅤG1691A變異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A及FⅤG1691A在中國變異率極低(均為為0.07%)，高加索人FⅡG20210A突變率為0.60%，F(xiàn)ⅤG1691A為2.4%。

Isordia等[14]對(duì)墨西哥青年腦梗死患者及對(duì)照者進(jìn)行分析，并未檢測(cè)出FⅤG1691A突變；Hashemi等[15]研究表明病例組FⅤG1691A雜合突變率為15.1%，對(duì)照組雜合突變率為8.3%，均未檢出純合突變型。由于FⅡG20210A及FⅤG1691A的分布差異及其在中國地區(qū)的低突變率，仍不能確定它們與腦梗死的關(guān)系，但是國外較多研究表明兩者與ACI之間存在聯(lián)系，Coen等[16]研究表明FⅡG20210A與FⅤG1691A基因多態(tài)性與ACI風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)；Theythey等[17]也發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A與LAA相關(guān)；Gawish等[18]對(duì)沙特阿拉伯72名腦動(dòng)脈血栓新生兒和70名無血栓栓塞家族史的健康新生兒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FⅡG20210A和FⅤG1691A基因突變可能是沙特新生兒及兒童中風(fēng)的重要危險(xiǎn)因素。

蛋白C系統(tǒng)是人體的抗凝系統(tǒng)之一，它包括蛋白C、蛋白S、內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM)和FⅤ組成[19]。蛋白C可滅活FⅤa而達(dá)到抗凝的作用，APCR是指在某些作用下蛋白C對(duì)FⅤa的滅活作用減弱，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，可能與腦梗死相關(guān)[7]。本研究對(duì)照組健康者APCR陽性率(4.67%)明顯低于ACI組(17.22%，P<0.05)，與國內(nèi)其他相關(guān)研究相似。研究發(fā)現(xiàn)，健康人群的APCR陽性率為3%～7%，但在血栓相關(guān)性疾病中高達(dá)19%～60%[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)[22]，年輕腦梗死患者(<45歲)約47%存在凝血問題，其中包括APCR、高心磷脂抗體等。本研究中腦梗死組APCR陽性率明顯高于對(duì)照組，且Logistics回歸分析也顯示APCR是ACI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.250，P=0.013)。

FⅦ基因含有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，F(xiàn)ⅦR353Q突變是指第8位外顯子的1個(gè)堿基突變，使第353位氨基酸密碼子由G變?yōu)锳，導(dǎo)致氨基酸由精氨酸變成谷氨酰胺[6]。血漿FⅦ水平受遺傳與環(huán)境的雙重影響[23]。研究表明，F(xiàn)Ⅶ基因型對(duì)活化FⅦ(activated coagulation factor,FⅦa)水平總變異的貢獻(xiàn)(30%)高于對(duì)FⅦ活性(25%)的貢獻(xiàn)，也就是說FⅦ基因多態(tài)性主要影響FⅦa的水平[6]；1994年已有研究表明具有高FⅦ活性的老年人更易患血管疾病[24]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FⅦ水平升高的小鼠腦梗死面積更大，這也間接說明了FⅦ的升高會(huì)導(dǎo)致更大面積的腦梗死[25]；Olson等[26]研究也表明FⅦ是ACI的危險(xiǎn)因素，但是也有結(jié)果相反的研究，Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)FⅦR353Q突變的個(gè)體FⅦ水平升高不明顯，且FⅦR353Q與血栓性疾病無關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組及對(duì)照組FⅦR353Q基因型及等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，特別是TOAST分型中的SAO型。早期血管內(nèi)皮反復(fù)受損，組織因子(tissue factor，TF)暴露于血漿，F(xiàn)Ⅶ常與TF共同作用，TF與血漿中含量極低的FⅦa結(jié)合形成復(fù)合物TF/FⅦa，而FⅦa又可正反饋活化FⅦ，在Ca2+和磷脂的參與下，激活FⅨ和FⅩ，即啟動(dòng)外源性凝血途徑，最終導(dǎo)致纖維蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生[28-29]。一項(xiàng)Mate分析研究評(píng)估了SAO與非腦梗死及其他TOAST亞型的腦梗死患者的凝血、纖溶、內(nèi)皮功能障礙及炎癥標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)腔隙性腦卒中患者凝血/纖溶指標(biāo)明顯高于非腦卒中患者，纖維蛋白原和D-二聚體在急性和慢性SAO中均顯著低于其他類型腦梗死，SAO與非腦卒中的內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物較高，與其他ACI亞型相比，SAO患者的血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)及IL-6水平明顯降低[30]。因此，除了凝血因子多態(tài)性，纖溶系統(tǒng)亢進(jìn)、內(nèi)皮功能障礙及凝血因子在SAO中也起了重要的作用。

Logistic回歸分析顯示吸煙、高血壓、高密度脂蛋白、APCR及FⅦR353Q基因型是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其Q等位基因可能是ACI的保護(hù)性因素，F(xiàn)ⅡG20210A及FⅤG1691A基因型因突變例數(shù)極少未納入回歸模型。

總之，本研究驗(yàn)證了FⅡG20210A及FⅤG1691A基因多態(tài)性在中國漢族地區(qū)的低分布，尚不能明確FⅡG20210A與FⅤG1691A基因多態(tài)性與ACI之間關(guān)系；FⅦR353Q與ACI相關(guān)，特別是SAO型，A等位基因可能是ACI的保護(hù)性因素，F(xiàn)ⅦR353Q與APCR可能是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但由于ACI是多因素疾病，且各因素之間相互作用仍未完全闡明，因此仍需更深入的基礎(chǔ)及臨床研究探索其發(fā)病機(jī)制。