循環(huán)腫瘤細(xì)胞聯(lián)合癌胚抗原檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中的臨床價(jià)值*

肖牘清，吳兆紅，譚博，王戈菲

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 心胸外科，廣東 廣州 510000)

肺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于缺乏特異性標(biāo)志物，70%NSCLC診斷時(shí)處于晚期，5年生存率不足15%[1-3]。在NSCLC中，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin-19 fragments,CYFRA21-1 )是最敏感的腫瘤標(biāo)志物[4-5]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)來(lái)源于原發(fā)腫瘤，可評(píng)估腫瘤的發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)，是目前最具潛力的腫瘤標(biāo)志物之一[6-8]。CTC與CEA均在NSCLC的診斷、分期、治療及預(yù)后方面有一定的作用，但由于其敏感性及特異性的問(wèn)題，二者在臨床中的應(yīng)用都有一定的局限性[9-10]。研究表明，CYFRA21-1、鱗狀上皮細(xì)胞抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag)及CEA等傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物和“液體活檢”[如CTC、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)等]是NSCLC診斷及監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)[11-12]。目前，傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)在臨床中已有較廣泛的應(yīng)用[13]，然而它們與CTC、ctDNA等聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用尚無(wú)進(jìn)一步的研究論證，因此本研究旨在探討NSCLC患者外周血傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA和液體活檢CTC聯(lián)合檢測(cè)的水平變化及臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象、主要試劑與儀器

1.1.1研究對(duì)象 選取2015年1月—2018年12月病理確診NSCLC患者54例作為研究組，男43例、女11例，平均(63.4±1.58)歲，腫瘤分期依據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(union for international cancer control，UICC)提出的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[14]Ⅰ～Ⅱ期19例、Ⅲ期14例及Ⅳ期21例，肺腺癌37例、肺鱗癌17例；選取肺部良性疾病患者21例作為對(duì)照組，男13例、女8例，平均(62.7±2.16)歲，肺炎18例和肺結(jié)核3例。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)研究組患者經(jīng)病理首次確診且未行放化療，(2)對(duì)照組患者經(jīng)影像學(xué)檢查或病理排除惡性病變，(3)所有患者及家屬同意并自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者診斷尚不明確，(2)患者既往有放化療病史，(3)患者有其他系統(tǒng)腫瘤或肝腎功能不全，(4)患者無(wú)法配合采集標(biāo)本和資料。2組患者年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批(2017069)。

1.1.2主要試劑與儀器 人體外周血白細(xì)胞去除試劑盒[含磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液、鼠抗人上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)抗體，批號(hào)HCDUB51001]和免疫熒光光原位雜交樣品處理試劑盒(含CD45抗體及染色體探針，批號(hào)IHIUB51001)購(gòu)自江蘇萊爾生物醫(yī)藥；全自動(dòng)電化學(xué)免疫發(fā)光儀與配套CEA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190917)購(gòu)自鄭州安圖生物醫(yī)藥。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠法檢測(cè)CTC 采用免疫磁珠法[15]分離富集CTC。采集2組患者清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，靜置48 h內(nèi)離心5 min，棄上清，加裂解液，混勻細(xì)胞，離心，棄上清，再次加入裂解液，重復(fù)混勻、離心后去上清；PBS洗滌免疫磁珠微粒，按每人份鼠抗人EPCAM抗體200 μL及10 μL加入前期處理好的樣本中，充分混勻、孵化30 min，再次沖洗、離心5 min，棄上清，加PBS至500 μL與抗體標(biāo)記的磁珠20 μL反應(yīng)20 min。免疫熒光原位雜交(immune fluorescence in situ hybridization，imFISH)檢測(cè)分析富集后細(xì)胞，CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，用8號(hào)著絲粒探針進(jìn)行熒光原位雜交；在熒光顯微鏡下通過(guò)雙免疫標(biāo)記對(duì)富集細(xì)胞做形態(tài)學(xué)分析。將8號(hào)染色體異常擴(kuò)增信號(hào)點(diǎn)>2個(gè)、CD45陰性的細(xì)胞定義為腫瘤細(xì)胞；CTC數(shù)量≥2個(gè)的研究對(duì)象定義為CTC陽(yáng)性[16]。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)CEA 采集2組患者清晨空腹血液標(biāo)本3 mL，ELISA法檢測(cè)血清CEA水平[17]，采用全自動(dòng)電化學(xué)免疫發(fā)光儀及原裝配套使用試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)患者血清中CEA濃度，血清CEA水平≥5 μg/L定義為CEA陽(yáng)性[18]。

1.2.3聯(lián)合檢測(cè) CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)為并聯(lián)檢測(cè)，即有一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性為聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性[19-20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CTC和CEA單獨(dú)檢測(cè)

研究組患者外周血CTC和CEA的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組患者CTC和CEA的陽(yáng)性率比較[n(%)]Tab.1 Comparison of the positive rates of CTC and CEA between two groups[n(%)]

2.2 ROC曲線結(jié)果

研究組患者ROC曲線結(jié)果顯示，CTCAUC為0.828，95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)為0.723～0.905；CEAAUC為0.738，95%CI為0.622～0.831，CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.737，95%CI為0.622～0.832。見(jiàn)圖1。

圖1 研究組CTC、CEA及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線結(jié)果Fig.1 ROC curves of CTC, CEA and combined detection in the research group

2.3 CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)

研究組患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.83，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于研究組Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.214，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.460，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)[n(%)]Tab.2 Combined detection of CTC and CEA [n(%)]

2.4 CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)和單一檢測(cè)的比較

研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)陽(yáng)性率與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

CTC由Ashworth于1869年首次提出，CTC與NSCLC的診斷、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有相關(guān)性[21-22]。

表3 CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)和單一檢測(cè)的比較[n(%)]Tab.3 Comparison of CTC and CEA combined detection and single detection[n(%)]

CEA為目前為NSCLC中應(yīng)用最為廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一，連續(xù)監(jiān)測(cè)CEA有助于NSCLC的診斷，評(píng)估預(yù)后和療效[23]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者外周血CTC和CEA單獨(dú)檢測(cè)陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.05)，CEA和CTC單獨(dú)檢測(cè)可以輔助診斷NSCLC。有研究表明，二者單獨(dú)檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用有一定的局限性，CTC檢測(cè)不僅花費(fèi)昂貴，而且敏感性較低，CTC在NSCLC中的應(yīng)用有局限，但在腫瘤生物標(biāo)志物中，CTC與CEA具有相關(guān)性[24]。

沈茜等[25]的研究結(jié)果顯示，將CTC≥2個(gè)/mL外周血或血清癌胚抗原(CEA)水平≥5 μg/L作為NSCLC診斷指標(biāo)時(shí)，敏感度為87.5%(119/136)，特異度為85.9%(128/149)，提示CTC和CEA在NSCLC的診斷中具有重要價(jià)值。Zhou等[26]研究也認(rèn)為CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)是在NSCLC中較好的一個(gè)預(yù)測(cè)模型。但目前研究?jī)H分析CTC或CEA單獨(dú)檢測(cè)的價(jià)值，以及CTC與CEA的相關(guān)性，尚未見(jiàn)臨床研究探討聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC的臨床價(jià)值。本研究ROC曲線結(jié)果顯示，研究組患者CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.737(95%CI為0.622～0.832)，且CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.05)，因此CEA和CTC聯(lián)合檢測(cè)也可輔助診斷NSCLC。此外，研究組Ⅲ～Ⅳ期患者聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率分別高于對(duì)照組和研究組Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，因此提示CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)與NSCLC分期密切相關(guān)，晚期NSCLC(Ⅲ～Ⅳ期)患者聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率高于早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者，臨床中可通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)CTC與CEA初步判斷患者分期，評(píng)估患者預(yù)后，指導(dǎo)治療，提高患者生存質(zhì)量。另外，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.05)，而研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)陽(yáng)性率與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者與對(duì)照組患者外周血CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)差異，CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)不能輔助檢測(cè)早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，而早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者外周血CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率高于對(duì)照組，CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)較單一檢測(cè)在臨床應(yīng)用中更具有優(yōu)勢(shì)，可以輔助診斷早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，為NSCLC患者早期治療提供依據(jù)，改善NSCLC患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

在臨床中，因受客觀因素的限制，部分病人無(wú)法利用金標(biāo)準(zhǔn)來(lái)診斷，若僅依靠臨床表現(xiàn)及單項(xiàng)指標(biāo)來(lái)診斷，則診斷的準(zhǔn)確性較低，而通過(guò)幾種指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷的準(zhǔn)確性[27-28]。CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)在NSCLC中的臨床研究較為常見(jiàn)[29-30]，而CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC中的臨床價(jià)值研究較少。Ding等[31]通過(guò)回歸分析證實(shí)CTC、CEA均為肺腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)CTC和CEA水平可作為提高肺腺癌診斷率的一種方法。本研究論證了CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC早期診斷中的臨床意義，二者聯(lián)合檢測(cè)不僅提高了CTC在NSCLC中的應(yīng)用價(jià)值，也為NSCLC高?；颊叩暮Y查提供了一種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)捷的方法。本研究結(jié)果顯示，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)陽(yáng)性率與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.05)，提示CTC和CEA聯(lián)合檢測(cè)在早期NSCLC的診斷中更具有優(yōu)勢(shì)。在臨床中，依靠腫瘤標(biāo)記物單一檢測(cè)診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC較困難，通過(guò)CTC和CEA聯(lián)合檢測(cè)可以輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC，必要時(shí)可聯(lián)合影像學(xué)結(jié)果共同判斷，可早期發(fā)現(xiàn)NSCLC，早期進(jìn)行干預(yù)，對(duì)提高NSCLC患者遠(yuǎn)期生存質(zhì)量有重要意義。

本研究存在以下不足，本研究為單中心研究，數(shù)據(jù)的選擇存在一定的偏差；作為回顧性分析，部分患者缺失隨訪資料，未能進(jìn)一步做預(yù)后生存分析；僅初步探討CTC與CEA聯(lián)合檢測(cè)在NSCLC患者中的臨床價(jià)值，CTC與CEA、CYFRA21-1及NSE等多種傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在肺癌早期診斷和推測(cè)預(yù)后的意義則有待進(jìn)一步論證。

總之，CTC、CEA單獨(dú)檢測(cè)及CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)均可輔助診斷NSCLC，CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)與NSCLC的分期有關(guān)，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)NSCLC患者CTC+CEA聯(lián)合檢測(cè)較高，CTC聯(lián)合CEA檢測(cè)較單一檢測(cè)更有助于輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC。對(duì)于NSCLC高?；颊?，應(yīng)聯(lián)合CTC與CEA水平進(jìn)行評(píng)估，早期診斷，明確分期，及早干預(yù)，更有利改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)生存期。