CD147和EGFR及HIF-1α在透明細胞腎細胞癌中的表達及意義

黃凇崧，何常，嚴瑞

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 病理學教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，腎內(nèi)科教研室，貴州 貴陽 550004)

腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，占成人腫瘤的3%[1-2]。腎細胞癌源于腎小管上皮細胞，分為4個亞型，其中最常見的病理類型是透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，占腎癌總數(shù)的75%[3]。細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(extracellar matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN；cluster of differentiation 147，CD147)，其作用是介導細胞間及細胞間質(zhì)間的粘附作用，通過多種途徑刺激腫瘤細胞及周圍間質(zhì)成纖維細胞合成并釋放基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤[4]；表皮生長因子受體(epidermal growth factor recepter，EGFR)是ErbB受體家族的一員，廣泛表達于細胞膜表面，與配體EGF結(jié)合后促進腫瘤細胞的增殖和生長[5]；缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被認為是腫瘤組織缺氧的內(nèi)在標志，同時也是腫瘤細胞缺氧的調(diào)節(jié)因素[6]。以往的研究對CD147、EGFR及HIF-1α單一檢測較多，對3者聯(lián)合檢測和相關(guān)關(guān)系探討較少[4-6]。因此，本研究通過分析CD147、EGFR及HIF-1α在不同臨床分期和病理分級的ccRCC標本和腎盂腎炎標本中的表達差異，探討CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源、主要試劑與儀器

1.1.1標本來源 收集2011年1月—2016年12月存檔的診斷為ccRCC的手術(shù)切除腎臟標本為ccRCC組，同期慢性腎盂腎炎病理標本作為對照組，要求所有病例均經(jīng)病理診斷證實，臨床病理資料完整且術(shù)前均未行放、化療及免疫治療。最終納入ccRCC組標本40例，年齡24～80歲、平均(56±18)歲，男24例、女16例，根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合委員會腎癌分期標準Ⅰ～Ⅳ期分別有16例、21例、2例及1例，按Fuhrman病理分級標準Ⅰ～Ⅳ級分別有14例、24例、1例及1例；對照組標本20例，年齡38～72歲、平均(52±12)歲，男13例、女7例，包括腎及輸尿管結(jié)石所致慢性腎盂腎炎16例，原發(fā)性慢性腎盂腎炎4例。

1.1.2主要試劑與儀器 鼠單抗CD147、鼠單抗EGFR、兔單抗HIF-1a及SP-9000二抗試劑盒(北京中杉金橋)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB，DAKO公司)，0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、4%中性甲醛、二甲苯、0.5%鹽酸酒精、1%碳酸鋰及蘇木素(德國merck)，石蠟切片(德國Leica公司)，BX517-32ETO型OLYMPUS正置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS)。

1.2方法

1.2.1腎組織中CD147、EGFR及HIF-1α蛋白的表達 應(yīng)用免疫組織化學鏈霉素抗生素蛋白-過氧化苯酶(streptavidin-perosidase，SP)法檢測腎組織中CD147、EGFR及HIF-1α的蛋白表達，提取細胞或者組織中的特定化學物質(zhì)，作為抗原或半抗原免疫兔子等實驗動物，制備特異性抗體(一抗)，再用一抗作為抗原去免疫動物制備二抗，并用生物素或辣根過氧化物酶處理后與前述抗原成分相結(jié)合，將抗原放大，DAB顯色，陽性部位顯示棕黃色顆粒。CD147、EGFR及HIF-1α一抗?jié)舛确謩e為1 ∶100、1 ∶100及1 ∶200，陰性對照片用PBS代替一抗，用已知為陽性的腎細胞癌為陽性對照。

1.2.2判讀標準 所有切片采用雙盲法，由2個病理醫(yī)師分別閱片評分。CD147以細胞膜著色為陽性，EGFR以細胞漿著色為陽性，HIF-1α以細胞漿(核)著色為陽性。每張切片計數(shù)10個高倍視野所有細胞及陽性著色細胞數(shù)，計算陽性百分率。按陽性細胞百分率無、<30%、30%～70%及>70%分別計0、1、2及3分，再根據(jù)染色強度為無、淺黃色、黃色及棕黃色分別計0、1、2及3分；將以上2項得分相加作為最后判斷結(jié)果，規(guī)定0分為“-”，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～6分為“+++”，最終將“-”和“+”計為陰性，“++”和“+++”計為陽性[7]。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示；定性數(shù)據(jù)以頻數(shù)、率或比(%)表示，組間差異采用χ2檢驗，表達強度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移和腫瘤分期之間的關(guān)系分析采用Kruskai-WallisH檢驗；P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CD147、EGFR及HIF-1α表達

結(jié)果顯示，CD147以細胞膜著色為陽性，EGFR以細胞漿著色為陽性，HIF-1α以細胞漿(核)著色為陽性(圖1)；ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 ccRCC組和對照組CD147、EGFR及HIF-1α 的表達(SP)

表1 ccRCC組和對照組CD147、EGFR及HIF-1α 的表達[n(%)]

2.2ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與病理分級的關(guān)系

結(jié)果顯示，隨著病理分級加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表達增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與臨床分期的關(guān)系

結(jié)果顯示，隨著臨床分期加深，CD147、EGFR及HIF-1α的表達增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

2.4ccRCC組CD147、EGFR和HIF-1α表達的相關(guān)分析

ccRCC組CD147與EGFR的表達呈正相關(guān)(r=0.990，P=0.010)，CD147和HIF-1α 亦呈正相關(guān)(r=0.963，P=0.037), EGFR與HIF-1α呈正相關(guān)(r=0.987，P=0.013)。

表2 ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與病理分級的關(guān)系[n(%)]

表3 ccRCC組CD147、EGFR及HIF-1α陽性表達級別與臨床分期的關(guān)系[n(%)]

3 討論

ccRCC多位于腎臟皮質(zhì)，實性多見，腫瘤與周圍腎組織分界較清楚，可形成推壓式邊界和假包膜[8]。腫瘤呈金黃色或多彩狀，含有脂質(zhì)，部分可見囊腔、壞死、出血和鈣化[9]。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤是一個多步驟及多階段的復雜過程，而在腫瘤細胞向鄰近組織浸潤和轉(zhuǎn)移過程中基底膜細胞基質(zhì)的降解是其中的必要階段，腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移受腫瘤微環(huán)境各種因素的影響[10]。ccRCC病變形成過程中涉及癌基因和抑癌基因的表達失調(diào)[11-12]。

CD147是由269 個氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白，相對分子量為45～55 kD，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin super family，IgSF)的成員之一[13]，分子的N端呈高度糖基化[14]。本次研究結(jié)果表明CD147的表達與腫瘤的病理分級相關(guān)，呈正相關(guān)關(guān)系，腫瘤細胞的分化程度越低，腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達強度就越強，提示腫瘤的分化一定程度上受CD147的影響[15-16]。本研究結(jié)果亦顯示CD147的表達強度與臨床分期呈正相關(guān)，表明CD147可以提示ccRCC的不良預后；對照組CD147的陽性表達率低于ccRCC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且組織分化程度越低，CD1147表達越強，這似乎提示CD147可能參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展過程，可影響腫瘤的惡性程度及演進。

EGFR是一種受體酪氨酸激酶，具有酪氨酸激酶活性，屬于ErbB 受體家族的成員，是細胞膜表面的糖蛋白受體，其相對分子量約為170 kD[14]。當EGFR與配體-EGF相結(jié)合，在EGFR酪氨酸激酶活性的作用下使酪氨酸殘基磷酸化激活EGFR，從而促進腫瘤細胞的增殖和生長[14]。腫瘤中EGFR通過調(diào)節(jié)與腫瘤細胞生長和增殖相關(guān)的信號通路，促進腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲，使腫瘤細胞表現(xiàn)出無限生長及增殖的特點[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在ccRCC中EGFR蛋白表達的陽性率為75%，EGFR在細胞膜或者胞漿混合表達結(jié)果沒有臨床病理意義，僅胞漿表達結(jié)果與腫瘤分級呈正相關(guān)關(guān)系。有學者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌血清EGFR的過高表達預示著腫瘤患者治療的預后不良[17]；有研究也表明EGFR在轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌的突變率顯著高于早期非小細胞肺癌，提示EGFR基因的突變影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，可通過預測 EGFR的突變率預估腫瘤的發(fā)展程度[18]；EGFR可以促進腫瘤血管的生成，從而增強腫瘤細胞的增殖能力，目前已經(jīng)成為了腫瘤治療的新靶點[17]。本研究結(jié)果亦顯示，EGFR陽性表達于胞漿，在ccRCC中呈高表達，表達量與ccRCC臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系，表明EGFR可能參與ccRCC的發(fā)生與進展。

在常氧時，HIF-α的半衰期非常短，是因為脯氨酸羥化酶(pro1yl hydroxylase，PHD)能夠識別其氧依賴降解區(qū)中兩個特殊的脯氨酸殘基并將其羥基化[19]。羥基化的HIF-α與腫瘤抑制蛋白(von Hippe1-Lindauprotein，pVHL)相結(jié)合，pVHL復合體通過聚集E3泛素連接酶，從而介導26S蛋白酶體對HIF-α的降解作用[20]；缺氧時，氧依賴降解區(qū)的PHD活性受到抑制，穩(wěn)定的HIF-β亞基和HIF-α亞基形成二聚體，從細胞質(zhì)穿到細胞核，最終連接到缺氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive，HRE)上啟動靶基因轉(zhuǎn)錄[19-20]。腫瘤細胞在缺氧的微環(huán)境中能被誘導產(chǎn)生HIF-1α，反之，HIF-1α的陽性區(qū)能提示腫瘤組織存在缺氧部位[21]。腫瘤細胞對適應(yīng)缺氧環(huán)境的辦法之一就是提高糖酵解效率，另一個重要的辦法就是形成多血管體系，使HIF-1α能夠加強其下游靶基因，從而通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成影響腫瘤微血管的密度，促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[21]。腫瘤細胞中低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)的活化還可以通過調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因，如VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及趨化因子受體4(chemokine receptor4，CXCR4)等的表達，促進腫瘤間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞增殖，從而維持腫瘤細胞的生存，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[22-24]。腎細胞癌為富含血管的實體腫瘤，實體腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管的形成，而新生血管的形成又依賴于腫瘤血管生長因子[25]。本實驗結(jié)果顯示，HIF-1α在ccRCC組織高表達與病理分級和臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果提示腫瘤的快速生長可導致腫瘤微環(huán)境呈缺氧狀態(tài)，使HIF-1α表達增多且明顯活化，幫助腫瘤細胞加快適應(yīng)缺氧微環(huán)境，從而加速了腫瘤細胞的異質(zhì)性和腫瘤血管生成，進而導致腫瘤侵襲力增強，患者預后差。

綜上所述，CD147、EGFR及HIF-1α在ccRCC中高表達，且與腫瘤分期正相關(guān)，提示腫瘤血管生成增多可能是CD147、EGFR及HIF-1α共同作用的結(jié)果。