川參通注射液中總酚酸、總黃酮及單糖大類成分的含量測定*

何峰，余明麗，姚光哲，張昀**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州瑞和制藥有限公司，貴州 貴陽 550002)

川參通注射液由丹參、當(dāng)歸、麥冬及川芎提取精制而成，臨床上用于良性前列腺增生癥所致的小便不暢、排尿費力及淋漓不盡等癥[1-2]。通過文獻調(diào)研及前期試驗發(fā)現(xiàn)，川參通處方中主要含有酚酸、黃酮、萜烯及糖類等成分[3]，其中酚酸是一類含有酚環(huán)的有機酸，包括單羥基苯甲酸和雙羥基苯甲酸等[4-5]；黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的活性化合物[6-8]；單糖是不能再水解的糖類，是構(gòu)成各種多糖的基本單位[9-11]。由于川參通注射液所含化學(xué)成分十分復(fù)雜，僅通過測定某個或某幾個化學(xué)成分的含量已無法滿足中藥注射劑的質(zhì)量控制要求，因此為盡可能地明確所含大類成分的種類及含量，本研究采用紫外分光光度法對川參通注射液中總酚酸、總黃酮和單糖大類成分進行分析和含量測定，確定大類成分在固形物中的比例，為川參通注射液質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 川參通注射液成品(批號170909～171015)，4 mL/支，購自貴州瑞和制藥有限公司；D-無水葡萄糖對照品(批號110833-201205)、原兒茶醛對照品(批號110810-201007)及蘆丁對照品(批號100080-201408)購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要儀器與試劑 TU-1810紫外分光光度計(北京普析)，GR-202電子天平(日本AND公司)，MS105分析天平(梅特勒公司)；鹽酸、硫酸及無水乙醇(成都科龍)，亞硝酸鈉(重慶江川)，硝酸鋁(汕頭西隴)，蒽酮(廣東光華)，實驗用水為純化水。

1.2方法

1.2.1總酚酸的含量測定 (1)溶液的制備：取原兒茶醛對照品適量，加1 mol/L鹽酸制成0.10 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置50 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸至刻度，取上述溶液1.0 mL置10 mL量瓶中用1 mol/L鹽酸至刻度，即得供試液。(2)線性關(guān)系：取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸至刻度，1 mol/L鹽酸作空白；于紫外分光光度計281 nm處測定吸光度，以標(biāo)樣濃度(mg/L)對吸收度(A)進行線性回歸[12]。(3)精密度和穩(wěn)定性：取對照品溶液0.7 mL，按照“(2)”項下重復(fù)測定5次，以峰面積計算精密度；取“(1)”項下稀釋溶液1 mL，測定不同時間的吸光度[13]。(4)重現(xiàn)性試驗：取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復(fù)測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取注射液(總酚酸為2.053 g/L)0.5 mL，置50 mL量瓶中，加入1 mol/L的鹽酸至刻度得樣品稀釋液；平行6次量取該稀釋液1 mL，置10 mL量瓶中，加入0.10 g/L的對照品溶液0.2 mL，加入1 mol/L的鹽酸至刻度作為供試品溶液，測定吸光度[14-15]。

1.2.2總黃酮的含量測定 (1)溶液的制備：取蘆丁對照品適量，加60%乙醇制成0.207 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，量取上述溶液1.0 mL至25.0 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min。加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min；加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，作為供試品溶液[16]。(2)線性關(guān)系：取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0及6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，按照“(1)”項下方法制備，用水6 mL同法做空白；于紫外分光光度計500 nm處測定吸收度，以標(biāo)樣濃度(g/L)對吸收度(A)進行線性回歸。(3)精密度和穩(wěn)定性：取對照品溶液4.0 mL，按照“(2)”項下重復(fù)測定5次，以峰面積計算精密度；取“(1)”項下稀釋溶液1 mL，測定不同時間的吸光度[17]。(4)重現(xiàn)性試驗：取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復(fù)測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取川參通注射液(總黃酮為18.3 g/L)0.5 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得樣品稀釋液；平行6次量取1 mL上述液至25 mL量瓶中，加入0.207 g/L的對照品溶液2 mL，按照“(1)”項下方法制備，作為供試品溶液，測定吸光度[18]。

1.2.3單糖的含量測定 (1)溶液的制備：取無水葡萄糖對照品適量，加水制成0.305 g/L的對照品溶液；取川參通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得樣品稀釋液。再量取上述液0.5 mL至10 mL試管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作為供試品溶液[19]。(2)線性關(guān)系：取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4及0.5 mL，分別置于10 mL試管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，于紫外分光光度計625 nm處測定吸收度，以標(biāo)樣濃度(mg/L)對吸收度(A)進行線性回歸。(3)精密度和穩(wěn)定性：取對照品溶液0.3 mL，按照“(2)”項下重復(fù)測定5次，以峰面積計算精密度。取“(1)”項下稀釋溶液0.5 mL，測定不同時間的吸光度。(4)重現(xiàn)性：量取同一批號(170909)川參通注射液，制備供試品溶液5份，重復(fù)測定5次，計算含量。(5)加樣回收率：取川參通注射液0.5 mL(單糖為53.1 g/L)，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度。平行6次量取上述液0.5 mL至10 mL試管中，分別加入0.030 5 g/L的對照品溶液1 mL，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作為供試品溶液，測定吸光度[20]。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

使用Excel 2007版軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計算精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，線性分析采用最小二乘法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.2含量測定

10批川參通注射液的總酚酸平均含量為2.05 g/L，其中最低含量為2.04 g/L，最高含量為2.06 g/L，各批次產(chǎn)品質(zhì)量相對較為均一，總酚酸平均含量占川參通注射液固含物的2.53%，占比較低；10批川參通注射液的總黃酮平均含量為18.21 g/L，其中最低含量為17.92 g/L，最高含量為18.52 g/L，各批次產(chǎn)品質(zhì)量相對較為均一，總黃酮平均含量占川參通注射液固含物的22.43%；10批川參通注射液的單糖平均含量為53.58 g/L，其中最低含量為52.91 g/L，最高含量為54.28 g/L，各批次產(chǎn)品質(zhì)量相對較為均一，單糖平均含量占川參通注射液固含物的66.01%，占比最高。

表1 不同批號川參通注射液中總酚酸、總黃酮及單糖的測定結(jié)果

3 討論

從10批川參通注射液的總酚酸、總黃酮和單糖的測定結(jié)果可以看出，廠家生產(chǎn)的成品批間均一性較好，不同批次間的差異性較小。3個大類成分中單糖含量最高，單糖測定中供試品的水解反應(yīng)至關(guān)重要，通過比較最終選擇蒽酮硫酸溶液作為反應(yīng)試劑，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好[22]。同時有報道硝酸鋁與總酚酸所形成的絡(luò)合物，其穩(wěn)定性較差，通過比較不適合應(yīng)用于川參通注射液中丹參總酚酸的測定，因此本實驗選擇鹽酸法進行總酚酸的測定[23]。本實驗運用紫外分光光度法對川參通注射液的總酚酸、總黃酮及單糖含量進行了測定，并對方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率進行了考察，結(jié)果表明所建立的分析方法精密度、穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性、加樣回收率好，符合定量分析要求。

測定波長的選擇依據(jù)的是每個化學(xué)成分都在對應(yīng)的波長下有特定的吸收，因此，選擇測定波長時，應(yīng)在一定的波長范圍內(nèi)掃描，選擇有最大吸收峰的波長作為測定波長[24]。例如在黃酮類化合物的紫外吸收帶中，不同的黃酮在統(tǒng)一吸收帶中的吸收強度各不相同，異黃酮在黃芪總黃酮中所占的比例較大，通過大量的實踐證實：使用紫外分光光度法測定特定波長下黃芪總黃酮的含量，不僅具備操作簡便的特點，而且具備良好的重現(xiàn)性[25]。最終通過實驗確定選擇通過測定500 nm吸收值測定總黃酮的含量，通過測定281 nm吸收值測定總酚酸的含量，通過測定625 nm吸收值測定單糖的含量。

川參通注射液為國家二類新藥，是目前臨床上唯一用于良性前列腺增生癥的純中藥注射劑，其局部靶向性的注射方式為產(chǎn)品療效提供確切保障，近年來為本省經(jīng)濟發(fā)展做出了較大貢獻。中藥具有多成分、多靶點的治療特點，單一的化學(xué)成分的含量已無法滿足其質(zhì)量控制要求[26]，因此大類成分的分析作為中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究不可或缺。根據(jù)《中藥注射劑安全性再評價質(zhì)量控制要點》等文件中關(guān)于中藥注射劑質(zhì)量控制要點的規(guī)定，多成分制成的注射劑所測各類成分之和應(yīng)大于總固體的80%[26]，本文在對川參通注射液大類成分研究時參考各藥味化學(xué)成分及提取精制工藝，選取總酚酸、總黃酮及單糖為檢測對象，涵蓋了該品種所具有的大類物質(zhì)基礎(chǔ)，同時分別選取品種中所含的原兒茶醛、蘆丁和D-無水葡萄糖為對照，大大增加了檢測結(jié)果的可靠性，本文研究有利于川參通注射液的深入研究，為該品種的安全性再評價工作提供了有力的實驗支撐。