miR-149-5p對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠Notch1表達(dá)和Treg/Th17免疫平衡的影響*

閆智永，張爽，唐橋斐

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉科，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種與免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)的過(guò)敏性疾病，近年AR的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。MicroRNAs(miRNAs)參與免疫細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，與免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-149-5p基因多態(tài)性與中國(guó)兒童AR和共病性哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)[3]，但參與機(jī)制不明，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AR主要是由輔助性T細(xì)胞1(T helper cells1，Th1)/T細(xì)胞2(T helper cells2，Th2)免疫失衡引起[4-5]。伴隨免疫學(xué)的快速發(fā)展，輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Treg)被發(fā)現(xiàn)在AR發(fā)病中扮演著重要角色[6-8]。有研究顯示，神經(jīng)源性位點(diǎn)缺口同系物蛋白(neurogenic locus notch homolog protein，Notch)通過(guò)抑制叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(fork-head box p3，F(xiàn)oxp3)表達(dá)和Treg細(xì)胞分化促進(jìn)AR發(fā)生[9]，桔皮素通過(guò)抑制Notch1/Jagged1信號(hào)通路影響T細(xì)胞分化，改善AR過(guò)敏癥狀[10]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Notch1是miR-149-5p的潛在靶基因，課題組進(jìn)一步采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-149-5p和Notch1的靶向關(guān)系，說(shuō)明miR-149-5p可能靶向調(diào)節(jié)Notch1參與AR發(fā)病，但對(duì)Treg/Th17細(xì)胞平衡的影響有待研究。因此，本研究擬建立BALB/c小鼠AR模型，探討miR-149-5p對(duì)AR小鼠Notch1表達(dá)和Treg/Th17細(xì)胞平衡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 6～8周齡雄性BALB/c小鼠12只，SPF級(jí)，體質(zhì)量16～18 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司[合格證號(hào)SCXK(遼)2015-0001]，于溫度18～22 ℃和濕度50～60 %環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周；人源胚胎腎細(xì)胞株293T購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2主要藥品和試劑 卵白蛋白(ovalbumin，OVA；美國(guó)Sigma)，蘇木精和SYBR Green熒光染料(中國(guó)Solarbio)，曙紅Y(上海生工生物)，全蛋白提取試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)液、一抗二抗去除液、Notch1抗體、叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(fork-head box p3，F(xiàn)oxp3)抗體、羊抗兔IgG-HRP及內(nèi)參抗體β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，沈陽(yáng)萬(wàn)類生物)，維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)抗體(中國(guó)Affinity)，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(加拿大Fermentas)，Super M-MLV RNA反轉(zhuǎn)錄酶(中國(guó)BioTeke公司)，小鼠IgE和白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(中國(guó)聯(lián)科生物)，小鼠白細(xì)胞介素-10(interleukin 10，IL-10)ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生生物)，熒光素酶檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱基生物)，miR-149-5p激動(dòng)劑(agomir)及陰性對(duì)照由中國(guó)吉瑪基因公司合成。

1.1.3主要儀器 RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)，DP73型顯微鏡拍照系統(tǒng)(日本OLUMPUS)，ELX-800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK)，DYY-7C型電泳儀及DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)，H-2050R型超速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀)，NW10LVF型超純水系統(tǒng)(香港Heal Force)，Exicycler 96型熒光定量PCR儀(韓國(guó)BIONEER)，NANO 2000型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo)，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備)。

1.2方法

1.2.1造模及分組 12只BALB/c小鼠，取3只作為正常組(不造模)，剩余9只小鼠建立AR模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為模型組、miR-149-5p激動(dòng)劑對(duì)照組和miR-149-5p激動(dòng)劑組。模型建立：稱取OVA 25 μg和氫氧化鋁[Al(OH)3]2 mg，加生理鹽水制備混懸液，于實(shí)驗(yàn)第1、7及14天對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射作為基礎(chǔ)致敏(200 μL/次)；第21天開(kāi)始自前鼻孔給予含3% OVA的生理鹽水進(jìn)行局部激發(fā)(20 μL/鼻孔)，連續(xù)14 d(即第21～34天)；激發(fā)致敏第28～34天時(shí)，分別于OVA激發(fā)前3 h向miR-149-5p激動(dòng)劑對(duì)照組小鼠鼻腔內(nèi)滴入miR-149-5pagomir陰性對(duì)照(5 nmol/L，10 μL/鼻孔)[11]，向miR-149-5p激動(dòng)劑組組小鼠鼻腔內(nèi)滴入相同劑量miR-149-5pagomir，正常組和模型組小鼠鼻滴等體積生理鹽水。

1.2.2行為學(xué)評(píng)分 于末次致敏30 min內(nèi)，觀察記錄各組小鼠流涕、鼻癢狀況和打噴嚏次數(shù)，其中清涕記分原則是流至前鼻孔為1分、超出前鼻孔為2分及涕流滿面為3分，鼻癢記分原則是輕搔鼻1～2次為1分、介于輕搔鼻和劇烈抓撓鼻面不止之間為2分、劇烈抓撓鼻面不止為3分，噴嚏記分原則是1～3個(gè)為1分、4～10個(gè)為2分及11個(gè)以上為3分，以上3項(xiàng)指標(biāo)合計(jì)為總分，總分范圍1～9分，超過(guò)5分說(shuō)明造模成功[12]。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)鼻黏膜組織的miR-149-5p表達(dá) 末次滴鼻后24 h腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死各組小鼠，取鼻黏膜組織，采用TRIpure法提取總RNA，測(cè)定濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光染料技術(shù)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)循環(huán)值(Ct)計(jì)算miR-149-5p相對(duì)表達(dá)量。Real-time PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.4蘇木精/伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察鼻黏膜組織病理學(xué)變化 末次滴鼻后24 h腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死小鼠，取小鼠鼻中隔黏膜，10%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制備切片，脫蠟水化后依次放入蘇木精和伊紅染色液中染色，脫水透明處理切片，滴加中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)變化，200×顯微鏡下拍照。

1.2.5ELISA檢測(cè)血清中IgE、IL-6及IL-10水平 末次滴鼻24 h后取各組小鼠眼眶靜脈血1 mL，離心分離血清，采用試劑盒檢測(cè)血清樣本中IgE、IL-6及IL-10水平，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本光密度(optical density，OD)通過(guò)回歸方程計(jì)算各指標(biāo)表達(dá)量。

1.2.6蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)鼻黏膜組織Notch1、RORγt及Foxp3蛋白表達(dá) 末次滴鼻后24 h腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死小鼠，取鼻黏膜組織，加入RIPA裂解液，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液得到樣本總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白上樣40 μg，十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)印，5%(M/V)脫脂奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，洗膜后加入二抗，37 ℃孵育5 min，噴灑ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光成像，分析目標(biāo)條帶光密度值，計(jì)算Notch1、RORγt及Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-149-5p與Notch1的靶向關(guān)系 miRDB網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-149-5p與Notch1 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建Notch1 3′-UTR區(qū)野生型(wild type，WT)和突變型(mutant type，MUT)熒光素酶報(bào)告載體，同miR-149-5pagomir或agomir陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，設(shè)置NC+Notch1(MUT)組、miR-149-5pagomir+Notch1(MUT)組、NC+Notch1(WT)組及miR-149-5pagomir+Notch1(WT)組；24孔板培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞裂解，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析各組細(xì)胞海腎(Renilla)和螢火蟲(chóng)(Firefly)熒光強(qiáng)度，以海腎熒光作為內(nèi)參照，計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)評(píng)分及病理學(xué)觀察

與正常組比較，模型組小鼠行為學(xué)評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，miR-149-5p激動(dòng)劑組行為學(xué)評(píng)分明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。HE染色結(jié)果顯示，模型組和miR-149-5p激動(dòng)劑對(duì)照組小鼠鼻黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，上皮不完整，有細(xì)胞脫落現(xiàn)象，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底增厚明顯，采用miR-149-5p激動(dòng)劑agomir干預(yù)后，小鼠鼻黏膜炎癥反應(yīng)減輕，只有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮結(jié)構(gòu)趨于完整(圖1)。

表2 各組小鼠行為學(xué)評(píng)分比較

圖1 各組小鼠鼻黏膜組織HE染色(200×)

2.2鼻黏膜組織miR-149-5p表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中miR-149-5p的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-149-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻黏膜組織miR-149-5p的表達(dá)增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3血清中IgE、IL-6及IL-10的水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清IgE、IL-6水平顯著升高，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，miR-149-5p激動(dòng)劑組小鼠血清中IgE、IL-6水平下降，IL-10水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4Notch1、RORγt及Foxp3蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中Notch1和RORγt蛋白的表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3蛋白的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-149-5p激動(dòng)劑組小鼠鼻黏膜組織Foxp3蛋白的表達(dá)增加，Notch1和RORγt蛋白的表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.5miR-149-5p對(duì)Notch1的調(diào)控作用

miRDB網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-149-5p與Notch1 3′-UTR存在互補(bǔ)位點(diǎn)(圖4)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC+Notch1(WT)組比較，miR-149-5pagomir+Notch1(WT)組的熒光素酶相對(duì)活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)，進(jìn)一步驗(yàn)證靶向關(guān)系。

3 討論

MicroRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度為18～22個(gè)核苷酸，在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中高度保守[13]。目前miRNAs被認(rèn)為是基因表達(dá)的基本調(diào)控機(jī)制之一，在控制細(xì)胞功能的每個(gè)方面都扮演著重要角色[14]。現(xiàn)已證明miR-146a、miR-199-3p及miR-466a-3p等眾多miRNA在AR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其表達(dá)異常已被作為AR易感性分子標(biāo)志物[15-16]。miR-149-5p位于2號(hào)染色體，通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體(toll like receptor，TLR)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transduction 3，STAT3)等信號(hào)抑制炎癥反應(yīng)，并參與多種疾病進(jìn)展，且和先天免疫功能失調(diào)有關(guān)[17-19]，然而miR-149-5p在AR中的作用及影響目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用OVA致敏建立AR小鼠模型，小鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，同正常組比較，AR組小鼠流涕嚴(yán)重，打噴嚏、搔鼻次數(shù)明顯增加，Real-time PCR檢測(cè)小鼠鼻黏膜組織中miR-149-5p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-149-5p在AR小鼠鼻黏膜組織中的表達(dá)減少，因此本研究推測(cè)miR-149-5p在AR發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

表3 各組小鼠血清IgE、IL-6及IL-10水平比較

注：(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

圖4 miR-149-5p與Notch1的靶向關(guān)系

注：(1)與NC+Notch1(WT)組比較，P<0.05。

AR是機(jī)體接觸變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的鼻炎膜非感染性炎性疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻癢、打噴嚏和流清涕等，嚴(yán)重影響患者精神和心理健康[20]。本研究在已明確miR-149-5p在AR小鼠鼻黏膜組織中低表達(dá)的情況下，給予小鼠鼻滴miR-149-5p激動(dòng)劑agomir，Real-time PCR結(jié)果顯示miR-149-5p被有效高表達(dá)，可以進(jìn)行后續(xù)研究。miR-149-5p高表達(dá)顯著降低AR小鼠打噴嚏、搔鼻次數(shù)。HE和ELISA染色結(jié)果顯示，miR-149-5p高表達(dá)后AR小鼠鼻黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，血清IgE水平下降，表明miR-149-5p過(guò)表達(dá)對(duì)AR小鼠發(fā)揮治療作用。

Notch受體是一種跨膜蛋白，由Notch1、Notch2、Notch3和Notch4四種組成[21]。在與配體結(jié)合后，受體被分泌酶蛋白酶裂解，釋放胞內(nèi)區(qū)域(notch intracellular domain，NICD)，可以誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，在癌細(xì)胞增殖、分化、器官形成等生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用[22]。業(yè)已證實(shí)，Notch信號(hào)途徑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞向T細(xì)胞分化，在早期T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[23-24]；更有研究發(fā)現(xiàn)，Notch1和Jagged1被證明在AR患者血清中的表達(dá)明顯減少，與過(guò)敏原特異性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)水平呈正相關(guān)[9]。本研究采用Western blot技術(shù)分析AR小鼠鼻黏膜組織中蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Notch1在模型組中的表達(dá)較正常組明顯增多，與miR-149-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同前述研究結(jié)果一致。

眾所周知，miRNAs通過(guò)與靶基因mRNA 3′-UTR區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致目標(biāo)基因降解或翻譯抑制，進(jìn)而調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)生過(guò)程，這種作用機(jī)制已經(jīng)在AR中被反復(fù)證明[25]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Notch1 3′-UTR區(qū)存在miR-149-5p反應(yīng)元件(metal response element，MRE)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC+Notch1(WT)組比較，miR-149-5pagomir+Notch1(WT)組的熒光素酶相對(duì)活性降低，說(shuō)明miR-149-5p可能通過(guò)靶向抑制Notch1參與AR進(jìn)展。

經(jīng)典免疫學(xué)說(shuō)認(rèn)為，AR是體外環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡而引起的以鼻黏膜Th2免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[26]。近年越多的研究證實(shí)，其他T細(xì)胞亞群(如Th17/Treg)細(xì)胞)也參與過(guò)敏性疾病的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程[27]，在這些群體中，Treg細(xì)胞因其在抑制其他效應(yīng)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞遷移和分化中的重要作用而被廣泛研究[28]。資料顯示，Notch1在AR患者中的表達(dá)與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[9]。而Foxp3是Treg的特征性標(biāo)志，其表達(dá)水平直接影響Treg細(xì)胞的分化和功能[29]。此外，Th17特有轉(zhuǎn)錄因子為RORγt，與Treg細(xì)胞在功能上相互拮抗，多項(xiàng)研究證實(shí)Treg/Th17細(xì)胞失衡與AR發(fā)病密切相關(guān)，提示Notch1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Treg和Th17細(xì)胞分化影響AR發(fā)病[30]。本研究給予小鼠鼻滴miR-149-5p激動(dòng)劑agomir上調(diào)miR-149-5p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-149-5p過(guò)表達(dá)可以降低促炎因子IL-6和Th17細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，升高抗炎因子IL-10和Treg細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，表明miR-149-5p靶向抑制Notch1后，會(huì)影響Treg/Th17細(xì)胞平衡。

綜上所述，在AR小鼠模型中，miR-149-5p可以靶向抑制Notch1表達(dá)，下調(diào)RORγt抑制Th17細(xì)胞分化，上調(diào)FoxP3促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，影響Treg/Th17免疫平衡，因此miR-149-5p可能為AR的治療提供新的方向。