BRCA2蛋白表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系*

孫紫君，楊宇石，黃瑾瑾，冉立，毛大華，鐘愉，徐澍*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第一位的女性惡性腫瘤[1]。研究表明，乳腺癌易感基因2(breast cancer suscepblilty gene 2，BRCA2)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及其家族遺傳性密切相關(guān)。BRCA2基因本質(zhì)上是一種抑癌基因，通過參與同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)達到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因此，BRCA2基因突變的女性患乳腺癌的風(fēng)險大大增加，并且其基因突變與乳腺癌的早期發(fā)病密切相關(guān)[2]。BRCA2基因突變往往是可遺傳的，而遺傳的BRCA2突變使攜帶者疾患早期發(fā)病的乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥的風(fēng)險大大增加[3-4]。在BRCA2突變細胞中，DNA損傷修復(fù)反應(yīng)被抑制，易導(dǎo)致出錯的DNA修復(fù)增加，最終引起基因組穩(wěn)定性降低[5]。BRCA2基因檢測的相關(guān)研究已經(jīng)成為乳腺癌及卵巢癌患者分子檢測的重要組成部分和研究內(nèi)容，研究發(fā)現(xiàn)的BRCA2的有意義突變?nèi)匀徽忌贁?shù)，某些BRCA2突變并不影響蛋白表達及增加患者疾患乳腺癌的概率，對乳腺癌診療意義不大，而且成本較高[6]。本研究采用臨床病理常用的免疫組化方法檢測乳腺實體腫瘤中BRCA2蛋白的表達，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，探究BRCA2蛋白在乳腺實體腫瘤中的表達狀況改變及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料

1.1.1對象 選取2008—2010年病理科97例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者蠟塊組織為研究對象，選擇同期30例癌旁正常乳腺組織作為對照；收集存檔切片，由2位乳腺病理專業(yè)的主任醫(yī)師雙盲法根據(jù)《WHO(2012版)乳腺病理學(xué)和遺傳學(xué)分冊》診斷標準重新判讀并分級[7]。乳腺癌分子分型依據(jù)最新標準：Luminal A(ER/PR陽性且PR>20%、HER-2陰性、Ki67<20%)，Luminal B樣HER2陰性(ER/PR陽性、HER-2陰性且PR<20%、Ki67>20%)，Luminal B樣HER2陽性型(ER/PR陽性、HER-2陽性)，HER2陽性型(ER和PR均陰性、HER-2陽性)，三陰性型(ER和PR均陰性、HER-2陰性)，所有HER-2陽性患者均行赫賽汀治療。

1.1.2主要試劑 兔抗人單克隆抗體BRCA2一抗(博士德)，檢測滴度為1 ∶50，一抗稀釋液(碧云天)，二抗稀釋液(碧云天)，二甲苯，無水乙醇，Mayer蘇木素染液(索萊寶)，公司山羊血清，檸檬酸鹽(均購于貴州永博鑫公司)，PBS粉劑(博士德公司)。

1.2方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測BRCA2蛋白，BRCA2蛋白表達定位于細胞核，免疫組化結(jié)果由2位主任病理醫(yī)師雙盲法按照以下標準評分：高倍鏡隨機選取10個視野，計數(shù)1 000個乳腺癌細胞或正常乳腺腺上皮細胞，以陽性細胞數(shù)/1 000為陽性百分率，陽性百分率評分標準定為1分(1%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)。免疫組化結(jié)果評分(IRS)為強度和百分比的乘積，根據(jù)IRS評分將BRCA2染色分為陰性(IRS 0)、弱(IRS 1～4)、中度(IRS 6～8)和強(IRS 9～12)，將免疫組化≤8分判讀為低水平表達組、≥9分者為高水平表達組[8]。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

收集97例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理特征(年齡、腫瘤大小、分子分型、月經(jīng)情況、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期)，使用χ2檢驗方法分析癌組織中BRCA2蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Kaplan-Meier-Meier和Longranktest統(tǒng)計學(xué)方法，分析不同水平的BRCA2表達與患者無進展生存時間(PFS)和總體生存時間(OS)的對比。

2 結(jié)果

2.1BRCA2蛋白在乳腺組織及乳腺癌中的表達

正常乳腺組織中BRCA2高水平表達率為90%，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高水平表達率為69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺組織中高水平表達高于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2BRCA2表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，癌組織中BRCA2蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、分子分型、月經(jīng)情況、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

正常乳腺組織 浸潤性導(dǎo)管癌

表1 乳腺癌組織中BRCA2表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3BRCA2表達與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

BRCA2表達與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4BRCA2表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

結(jié)果顯示，癌組織中BRCA2蛋白表達與患者PFS及OS有關(guān)(P=0.049、0.036)。見圖2。

圖2 BRCA2表達與患者PFS及OS的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的過程，引發(fā)腫瘤的往往是調(diào)節(jié)基因組完整性、細胞分裂和死亡基因的多種突變。細胞基因組的完整性受DNA損傷信號和DNA修復(fù)機制的密切調(diào)控。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2與乳腺癌和卵巢癌發(fā)展的關(guān)系在20多年前就已經(jīng)得到證實[9]。BRCA基因突變就與基因組不穩(wěn)定和許多惡性腫瘤發(fā)病率增加有關(guān)[10-11]?；蚪M不穩(wěn)定性是正常細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進一步惡化的動力。BRCA基因?qū)儆诿氀軘U張性共濟失調(diào)突變(ataxia-telangiectasia mutated ATM)介導(dǎo)的DNA DSBs修復(fù)信號通路家族，在維護基因組完整性方面發(fā)揮重要作用[12-13]。其中，BRCA2基因的有害突變可能導(dǎo)致DNA損傷的積累，使女性攜帶者更易患乳腺癌和卵巢惡性腫瘤，通常在絕經(jīng)前發(fā)生[14]。BRCA2突變對乳腺癌的組織學(xué)病理狀態(tài)、分期和分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有影響，是決定乳腺癌預(yù)后和生存率的因素[15]?？偟膩碚f，與其他基因突變攜帶者相比，BRCA2的攜帶者表現(xiàn)出更高的腫瘤分期、分級和ER表達陰性，并表現(xiàn)出更多的血管侵犯[16]。在一項針對日本乳腺原位癌患者的基因研究中發(fā)現(xiàn)，BRCA2基因突變引發(fā)的腫瘤是常是中或低分化的。BRCA2基因突變攜帶者和非攜帶者之間的組織學(xué)等級沒有顯著差異。但是與非攜帶者相比，BRCA2基因突變的患者常表現(xiàn)為2級或3級。BRCA2突變對于乳腺癌的患病率本身沒有顯著影響，但是BRCA2基因突變的患者發(fā)病年齡顯著提前[17]。

BRCA2(13q12.3，染色體13:堿基對32、315、479～32、399、671)是一種大的3 418個氨基酸蛋白。它包含27個外顯子，覆蓋了大約84.2 kb的基因組DNA[18]。在n端BRCA2包含一個轉(zhuǎn)錄激活域(TAD)。中間部分由外顯子11編碼，包含8個與RAD5126結(jié)合的被稱為BRC重復(fù)序列的保守基序。一個DNA結(jié)合域位于BRCA2蛋白的羧基端，由保守的螺旋結(jié)構(gòu)域、3個寡核苷酸結(jié)合折疊(OB)和一個(T)結(jié)構(gòu)域組裝而成，有利于BRCA2結(jié)合雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈DNA(ssDNA)。BRCA2的C端包含兩個NLS和一個TR2結(jié)構(gòu)域。時至今日，已經(jīng)在BRCA2中發(fā)現(xiàn)了1 800多個突變。這些突變主要包括移碼插入、缺失和無義突變，導(dǎo)致早期截斷或非功能蛋白產(chǎn)生。BRCA2基因突變不僅容易導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌，還與惡性皮膚和眼部黑色素瘤、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌和胃癌有關(guān)[19-22]。

BRCA2蛋白通過同源重組完成精確的DNA損傷后修復(fù)過程，在維持基因組完整性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。BRCA2蛋白功能的喪失可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，使得DNA損傷在細胞中不斷堆積，最終導(dǎo)致非致瘤細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤啟動細胞或腫瘤干細胞(CSCs)并且向進一步的腫瘤進化。研究表明，即使是同一腫瘤內(nèi)的癌細胞，其引發(fā)腫瘤的能力，在程度上有很大的不同。CSCs群體具有長期的自我更新能力，并具有分化為其他腫瘤細胞類型和啟動腫瘤生長的潛力[23]。鑒于CSCs具有廣泛的自我更新和克隆潛能，再加上腫瘤細胞具有高度的基因組不穩(wěn)定性，CSCs可能作為癌癥進化的引擎發(fā)揮作用。因此，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性依賴于CSCs的進化，這反映在新出現(xiàn)腫瘤克隆的數(shù)量上[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織中BRCA2高水平表達率為90%，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高水平表達率為69.1%，BRCA2蛋白在正常乳腺組織中高水平表達顯著高于乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(P<0.05)。說明BRCA2蛋白可能通過促進DNA損傷修復(fù)對乳腺組織起保護作用,BRCA2蛋白的表達缺失可能導(dǎo)致乳腺癌.BRCA2蛋白與乳腺癌預(yù)后情況存在顯著相關(guān)性，低水平表達時腫瘤預(yù)后較差(P<0.05)。綜合本組實驗結(jié)果及過往研究，BRCA2低水平表達與乳腺癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，其作用機制可能與BRCA2蛋白維持基因組完整性有關(guān)，當BRCA2蛋白低水平表達時，其促進DNA損傷修復(fù)的功能降低，基因組的穩(wěn)定性和完整性遭到破壞，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤干細胞的形成。最終導(dǎo)致較差的預(yù)后。而BRCA2表達與年齡、腫瘤大小、分子分型、月經(jīng)情況、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與本研究的病例有限有關(guān)。總而言之，BRCA2蛋白表達對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后的具有預(yù)測價值。