吉法酯保護(hù)干眼癥大鼠的機(jī)制研究*

糜玲，周波，李永1,，彭金剛1,，湯磊，黃家宇*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

干眼癥是眼科常見疾病，由多種因素誘發(fā)，癥狀因人而異，常見癥狀有異物感、干澀感、眼癢、分泌物黏稠、畏光以及視力波動(dòng)等[1]。近年來，隨著對(duì)干眼癥的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的干眼癥病理機(jī)制都有炎癥因子的參與[2-3]，同時(shí)細(xì)胞凋亡也起著關(guān)鍵性的作用[4-8]。淚腺細(xì)胞凋亡的增加可以減少淚液的分泌，同時(shí)引起眼部相關(guān)組織的損傷[9]；淚腺細(xì)胞長(zhǎng)期的凋亡和損傷會(huì)造成眼部相關(guān)組織炎癥保持持續(xù)的激活狀態(tài)，炎癥和凋亡相互影響，從而使干眼癥患者更容易產(chǎn)生眼干、眼澀等不適癥狀[10]。吉法酯(Gefarnate)是一種促黏蛋白分泌劑，不但做為胃黏膜保護(hù)劑在臨床上得到廣泛使用[11]，而且對(duì)干眼癥也有一定的保護(hù)作用，Dota等[12]研究發(fā)現(xiàn)吉法酯可以增加結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量及促進(jìn)黏蛋白5AC(mucoprotein-5AC, MUC5AC)等黏蛋白分泌，恢復(fù)并保護(hù)淚膜的完整性，改善角膜表皮的損傷，當(dāng)劑量高于0.3%時(shí)效果顯著且未觀察到明顯副作用；Toshida等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)吉法酯在兔結(jié)膜堿灼燒模型中也獲得同樣結(jié)果，但具體的保護(hù)機(jī)制尚不明確。吉法酯存在2種構(gòu)型，即4Z構(gòu)型和4E構(gòu)型，市售吉法酯是這兩種異構(gòu)體的混合物，且4Z ∶4E≈30 ∶70[15]。本課題組前期建立了單一構(gòu)型吉法酯的合成路線，并分別合成了兩種單一構(gòu)型吉法酯(純度>98%)供本次研究使用[16-17]。因此，本研究通過使用蛋白印記分析法(Western blot)檢測(cè)大鼠淚腺中活化的半胱氨酸蛋白3(Cleaved-Caspase 3)、B淋巴細(xì)胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、Bcl2關(guān)聯(lián)的X蛋白(Bcl2-Associated X, Bax)、Bcl2相關(guān)的死亡促進(jìn)蛋白(Bcl2-Associated death promoter, Bad)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metallo Protein-9, MMP 9)的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)染色觀察眼表MUC5AC及MMP-9的表達(dá)來探討不同構(gòu)型吉法酯對(duì)干眼癥大鼠的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雌性Wistar大鼠，6周齡，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。在各12 h明暗周期、濕度40%～50%的22 ℃飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2主要藥物和試劑 4Z構(gòu)型和4E構(gòu)型吉法酯由貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湯磊教授課題組制備，純度大于98%；RIPA裂解液和彩虹廣譜蛋白marker(北京索萊寶)，鼠單克隆抗體Bax、Bad及Bcl2(美國(guó)Santa)，兔單克隆抗體Cleaved-Caspase 3(美國(guó)CST)，熒光二抗兔抗和鼠抗(英國(guó)Abcam)，β-Actin、GAPDH、MMP9、MUC5AC抗體及SA1022免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德)，脫脂奶粉(北京博奧拓達(dá))，SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及PMSF(上海碧云天)，ZLI-9018DAB顯示試劑盒(北京中杉金橋)。

1.1.3主要儀器 Odyssey CLx近紅外熒光成像儀(美國(guó)Gene)，SDS-PAGE電泳儀(德國(guó)BioRaid)，NIKON TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon)，P70D20N1P-G5微波爐(廣東格萊士)，手持勻漿機(jī)(北京天根生化科技)。

1.2方法

1.2.1干眼癥動(dòng)物模型的建立及分組 40只大鼠隨機(jī)分為正常組、生理鹽水組、4Z吉法酯治療組(4Z組)、4E吉法酯治療組(4E組)和混合吉法酯治療組(4Z ∶4E=30 ∶70，混合組)，每組8只。除正常組外，其余組大鼠建立干眼癥模型，即皮下注射6 g/L東莨菪堿氫溴酸鹽，4次/d，0.5 mL/次，持續(xù)28 d，同時(shí)采用風(fēng)扇聯(lián)合除濕機(jī)模擬高流通性、低濕度(相對(duì)濕度為30%～40%)的環(huán)境，其中4Z組、4E組及混合組分別使用10 g/L的各構(gòu)型吉法酯滴眼液治療，生理鹽水組用同體積的生理鹽水滴眼，5次/d(9、11、13、15及17點(diǎn))，每只眼睛20 μL/次，連續(xù)治療2周。正常組大鼠置于正常環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2取材 治療14 d后冰上斷頸處死大鼠，迅速取出淚腺和眼球。眼球固定于Bouin氏固定液保存于4 ℃，淚腺保存于-80 ℃。固定72 h后眼球進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋處理，平行于眼軸作6 μm連續(xù)切片；-80 ℃冰箱取出淚腺組織，加入400 μL RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)后剪碎組織，在冰上使用手持勻漿機(jī)研磨成漿后冰上靜置1 h，3 340 r/min，4 ℃離心30 min，吸取上清液保存于-80 ℃?zhèn)溆?。蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min后蛋白保存于-20 ℃。

1.2.3免疫組織化學(xué) 組織切片常規(guī)梯度乙醇脫蠟至水后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書步驟進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉后甩干不洗，加入相應(yīng)一抗與組織切片4 ℃孵育過夜，第2天PBS清洗后與親和素標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育，顯微鏡下DAB顯色，當(dāng)組織呈現(xiàn)棕色即陽(yáng)性顯色反應(yīng)時(shí)洗去DAB，蘇木素復(fù)染后脫水封片，200倍顯微鏡下觀察MMP9和MUC5AC的表達(dá)。

1.2.4Western blot 按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書制備相應(yīng)濃度分離膠和上層膠，各組蛋白按60 μg上樣(Cleaved-Caspase 3上樣量為120 μg)。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃與相應(yīng)一抗孵育過夜，第2天孵育二抗后使用Odyssey CLx近紅外熒光成像儀進(jìn)行曝光，拍攝β-Actin、GAPDH、Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、MMP9及Bcl2蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

蛋白質(zhì)的灰度值、免疫組織化學(xué)陽(yáng)性面積統(tǒng)計(jì)均使用Image J V1.8.0軟件，使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1眼表黏蛋白表達(dá)

與生理鹽水組相比，4Z、4E和混合組大鼠眼表上皮細(xì)胞的MUC5AC表達(dá)均增加(P<0.05或P<0.01)，且4E組和混合組分別高于4Z組(P<0.05)。見圖1。

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與4Z組比較，P<0.01。

2.2眼表和淚腺炎癥因子MMP-9表達(dá)

與生理鹽水組相比，4Z、4E和混合組大鼠眼表和淚腺中MMP-9的表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01)，且4E組在眼表和淚腺中均低于4Z組(P<0.05)，但混合組大鼠僅淚腺中MMP-9的表達(dá)低于4Z組(P<0.05)。見圖2和圖3。

注：(1)與生理鹽水組比較，P<0.01；(2)與4Z組相比，P<0.05。

注：(1)與生理鹽水組比較，P<0.05；(2)與4Z組相比，P<0.05。

2.3淚腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表達(dá)

4Z、4E和混合組大鼠淚腺Cleaved-Caspase3、Bax及Bad蛋白表達(dá)較生理鹽水組減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)；與4Z組相比，4E組大鼠淚腺中Bcl-2的表達(dá)增加，Cleaved-Caspase3、Bax及Bad表達(dá)減少，而混合組僅Bcl2表達(dá)增加和Cleaved-Caspase3表達(dá)減少(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

3 討論

在干眼癥的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞凋亡起著重要的作用，已有研究顯示干眼癥患者結(jié)膜組織上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達(dá)增高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡指數(shù)上升，促凋亡因子與致炎因子表達(dá)的增加激活凋亡通路[18]；狗干眼模型中發(fā)現(xiàn)凋亡標(biāo)志物p53的存在，同時(shí)在淚腺中發(fā)現(xiàn)Bcl2蛋白和凋亡誘導(dǎo)因子Bax的失衡能導(dǎo)致凋亡率上升[19]。在凋亡過程中，Caspase家族起著重要的作用，已在多個(gè)干眼癥模型中發(fā)現(xiàn)Caspase家族的身影[20]。本研究利用蛋白免疫印跡法對(duì)淚腺中與凋亡相關(guān)的蛋白Caspase 3、Bax、Bad及Bcl2進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)過各種構(gòu)型吉法酯的治療后，與生理鹽水組相比，Bax、Bad及Caspase 3在淚腺中的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)，Bcl 2表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，且4E組對(duì)這些蛋白的調(diào)控作用明顯優(yōu)于4Z構(gòu)型，而混合組僅Bcl2表達(dá)增加和Cleaved-Caspase3表達(dá)減少。這指示在對(duì)干眼癥大鼠的保護(hù)作用中，抑制淚腺細(xì)胞凋亡方面，吉法酯通過抑制淚腺細(xì)胞的凋亡保護(hù)干眼癥大鼠，且4E構(gòu)型的保護(hù)作用優(yōu)于4Z構(gòu)型。

注：與生理鹽水組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與4Z組相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01。

炎癥在近年干眼癥的研究中已被多次證明，在干眼患者的眼表、淚腺和連接神經(jīng)的整合系統(tǒng)出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的顯著增多，同時(shí)發(fā)揮抗炎作用的乳鐵蛋白分泌顯著減少[4-5]。炎癥既是改變干眼病理的誘因，同時(shí)也是病變進(jìn)一步發(fā)展的結(jié)果[21]。本次實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)淚腺中MMP9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，經(jīng)吉法酯治療后，4Z、4E和混合組淚腺和眼表中發(fā)現(xiàn)少M(fèi)MP9表達(dá)(P<0.05)，且4E組及混合組MMP9在眼表和淚腺中的表達(dá)水平明顯低于4Z組。這提示吉法酯能通過抑制干眼癥大鼠的淚腺及眼表的炎癥保護(hù)干眼癥大鼠，且4E吉法酯的保護(hù)作用優(yōu)于4Z吉法酯。

近年來，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的缺失導(dǎo)致黏蛋白分泌減少，進(jìn)而引起淚膜不穩(wěn)定已引發(fā)學(xué)者們的關(guān)注[21]。眼表上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生膜結(jié)合型黏蛋白，與分泌性黏蛋白形成保護(hù)、潤(rùn)滑眼表的親水性屏障，分泌性黏蛋白包括可溶性與形成凝膠的MUC5AC，有助于淚液的穩(wěn)定性以及保持淚膜的親水性[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)干眼癥大鼠的眼表MUC5AC表達(dá)明顯下降，各構(gòu)型吉法酯能明顯增加眼表MUC5AC的表達(dá)量，且4E組多于4Z組(P<0.05)。

綜上所述，本次研究結(jié)果表明各構(gòu)型吉法酯可以增加干眼癥大鼠眼表MUC5AC的表達(dá)，減少淚腺中Cleaved-Caspase 3、Bax、Bad、Bcl及MMP-9的表達(dá)，且4E構(gòu)型吉法酯和混合式吉法酯優(yōu)于4Z構(gòu)型吉法酯。