沉默Linc00152對胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2侵襲及遷移的影響*

何美玲，楊喆，戴研平，雷珊，高曉勤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563006)

胰腺癌作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，是發(fā)達(dá)國家癌癥相關(guān)死亡的第四大病因，患者的總體5年生存率約為8%[1]。由于胰腺癌起病隱匿，早期不易被診斷，許多患者確診時癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不能編碼蛋白質(zhì)，在各種腫瘤中異常表達(dá)[3]。研究表明，lncRNA Linc00152在乳腺癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，下調(diào)Linc00152可顯著抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[4]；Linc00152在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中通過miR/AKT2/NF-κB在體內(nèi)體外發(fā)揮致癌作用[5]；Linc00152可直接與miR-193a/b-3p結(jié)合調(diào)節(jié)CCND1的表達(dá)，從而影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[6]。然而，有關(guān)Linc00152在胰腺癌中的生物學(xué)功能和潛在機(jī)制卻鮮有報道。本研究通過敲低胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2中Linc00152表達(dá)，探討Linc00152對胰腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響，為治療胰腺癌建立潛在的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

20例配對的人胰腺癌組織及相對應(yīng)癌旁組織收集于華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰科。胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2、BxPC-3、Capan2及人胰腺正常細(xì)胞HPDE均購于美國ATCC細(xì)胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD公司，RT試劑盒、PCR相關(guān)SYBRP及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自鼎國生物有限公司，兔抗人單克隆抗體vimentin和N-cadherin及鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自武漢賽威爾生物技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000和相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。Linc00152的沉默RNA(siRNA)、陰性對照序列(NC)、Linc00152及GAPDH上下游引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MIA PaCa-2細(xì)胞和HPDE培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基，BxPC-3細(xì)胞和Capan2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞均在10% 胎牛血清、5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達(dá)85%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2Linc00152的相對表達(dá)量檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法檢測，Trizol法提取人胰腺癌組織、癌旁組織或各細(xì)胞株中的總RNA，按試劑盒說明書操作。經(jīng)70%乙醇洗滌后的RNA加無RNA酶雙蒸水水稀釋，測定RNA濃度及純度。取總RNA 1 μg，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用RT-q PCR法測定Linc00152的表達(dá)水平。本研究以GAPDH為內(nèi)參照，Linc00152上游引物序列為5′-AAAATCACGACTCAGCCCCC-3′、下游引物序列為5′-AATGGGAAACCGACCAGACC-3′，GAPDH上游引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，以2-ΔΔCt計算分析結(jié)果。選擇Linc00152的相對表達(dá)水平最高的胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)進(jìn)行下一步的研究。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾效率檢測 取對數(shù)生長期MIA PaCa-2細(xì)胞(Linc00152的相對表達(dá)水平最高)胰酶消化后重懸，調(diào)整密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合65%左右時換液。將MIA PaCa-2細(xì)胞分為Linc00152沉默組和NC組，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Linc00152沉默組轉(zhuǎn)染si-RNA抑制序列沉默Linc00152的表達(dá)，NC組轉(zhuǎn)染陰性對照序列(si-NC)作為對照(NC組)。si-RNA序列為TAGGCGATACGATGCTTTA-3′，si-NC序列為TAATCGCTACGATGCACTA-3′。轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)42 h后，步驟同1.2.2。

1.2.4沉默Linc00152后MIA PaCa-2侵襲與遷移的細(xì)胞數(shù) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測，侵襲實(shí)驗(yàn)：取已經(jīng)稀釋過的magtrigel基質(zhì)膠50 μL加入transwell小室，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min。調(diào)整2組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株MIA PaCa-2密度為2×107/L，取細(xì)胞懸液200 μL接種于鋪有magtrigel的上室中。上室為無血清培養(yǎng)基，下室為20%胎牛血清完全培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS 洗凈后于100倍顯微鏡下拍照并記數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)但不加magtrigel。

1.2.5沉默Linc00152后MIA PaCa-2細(xì)胞的相對劃痕愈合率 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測，分別將2組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株MIA PaCa-2細(xì)胞鋪板，36 h后200 μL槍頭進(jìn)行劃痕(槍頭經(jīng)高壓滅菌)，PBS洗凈3次，換無血清培養(yǎng)基后100倍顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再次拍照，測量圖片中劃痕寬度，計算相對劃痕愈合率。相對劃痕愈合率=(平均初始劃痕寬度-平均終末劃痕寬度)/平均初始劃痕寬度×100%。

1.2.6沉默Linc00152后MIA PaCa-2細(xì)胞vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測，蛋白裂解液分別處理2組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株MIA PaCa-2后提取總蛋白，BAC法測定蛋白濃度，依次制膠、上樣、電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、洗轉(zhuǎn)印膜后，5%的脫脂奶粉搖床上室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜。TBST洗滌3次，將PVDF膜放入二抗中室溫孵育2 h，加ECL化學(xué)發(fā)光液處理，曝光后進(jìn)行圖像處理和灰度分析。研究設(shè)GAPDH作為內(nèi)參照。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)水平

如圖1所示，Linc00152在胰腺癌組織中表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Linc00152在胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2、Bxpc-3及Capan2中的表達(dá)高于人胰腺正常HPDE細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且在MIA PaCa-2中表達(dá)最高。

注：與HPDE比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01；(3)與Normal比較，P<0.001。

2.2轉(zhuǎn)染si-RNA后MIA PaCa-2轉(zhuǎn)染效率

沉默組轉(zhuǎn)染si-RNA抑制序列沉默Linc00152表達(dá)MIA PaCa-2 48h后，結(jié)果顯示，與NC組比較，Linc00152沉默組細(xì)胞中Linc00152表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。表明成功轉(zhuǎn)染Linc00152抑制序列下調(diào)了Linc00152的表達(dá)。

注：(1)與NC組比較，P<0.01。

2.3沉默Linc00152后MIA PaCa-2侵襲與遷移的細(xì)胞數(shù)

如圖3顯示，與NC組比較，沉默組侵襲及遷移的MIA PaCa-2細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞的侵襲與遷移能力均減弱。

2.4沉默Linc00152后MIA PaCa-2細(xì)胞的相對劃痕愈合率

如圖4所示，沉默Linc00152 48h后，細(xì)胞的相對劃痕愈合率明顯比si-NC組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞的遷移能力減弱。

2.5沉默Linc00152后MIA PaCa-2細(xì)胞vimentin及N-cadherin蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與NC組比較，沉默組MIA PaCa-2細(xì)胞vimentin及N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注：A為侵襲實(shí)驗(yàn)，B為遷移實(shí)驗(yàn)；(1)與NC組比較，P<0.01。

注：A為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，B為相對劃痕愈合率；(1)與NC組比較，P<0.01。

注：A為Western blot電泳結(jié)果，B為Western blot結(jié)果條形圖；(1)與NC組比較，P<0.01。

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，因其早期發(fā)現(xiàn)困難，且當(dāng)前各種治療效果有限，預(yù)后極差。雖然近年來臨床手術(shù)及各種綜合治療方法有所改進(jìn)，但患者5年生存率始終極低，其主要原因之一就是胰腺癌具有高度侵襲轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)特性，盡早明確胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制對改善其治療現(xiàn)狀非常必要。

LncRNA越來越受到研究者的廣泛關(guān)注，研究表明，lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-11]，并從多種途徑上調(diào)控基因的表達(dá)水平，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及表觀遺傳調(diào)控等[12-13]。有研究表明，Linc00152在卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)能抑制卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖[14]，且Linc00152與多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[15]。盡管Linc00152逐步被證實(shí)為多種人類惡性腫瘤形成的重要的基因表達(dá)調(diào)控器，但是其與胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系卻鮮有報道。

本研究通過RT-qPCR法檢測Linc00152在胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，Linc00152在胰腺癌組織中高表達(dá)；在幾種胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況與在胰腺癌組織中的表達(dá)情況一致，Linc00152在人正常胰腺細(xì)胞HPDE中呈低表達(dá)，而在胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2、BxPC-3及Capan2中均高表達(dá)，提示Linc00152可能參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進(jìn)一步研究Linc00152與胰腺癌進(jìn)展的關(guān)系，本研究選擇Linc00152相對表達(dá)量最高的胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2作為研究細(xì)胞，通過在該細(xì)胞中沉默Linc00152表達(dá)，采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察MIA PaCa-2細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移數(shù)目、采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察MIA PaCa-2細(xì)胞的相對劃痕愈合率，結(jié)果顯示，沉默Linc00152后，MIA PaCa-2細(xì)胞侵襲與遷移的細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，提示沉默Linc00152可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是一種賦予上皮腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)特性的過程，包括黏附性降低和運(yùn)動性增加，是驅(qū)動癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的重要過程，已有研究證明EMT參與腫瘤轉(zhuǎn)移[16-17]。N-cadherin的異常調(diào)節(jié)與各種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18-19]，vimentin是一種上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的中間纖維，研究證明可促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的遷移[20]，這2個間充質(zhì)標(biāo)志物的增加在腫瘤轉(zhuǎn)移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。為了深入了解沉默Linc00152對細(xì)胞侵襲調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，對沉默Linc00152后胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞進(jìn)行了Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默Linc00152可顯著下調(diào)胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞中vimentin及N-cadherin的表達(dá)，提示沉默Linc00152能抑制EMT進(jìn)程。且同時結(jié)合Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示沉默Linc00152可能是通過下調(diào)vimentin、N-cadherin的表達(dá)從而抑制EMT進(jìn)程來抑制胰腺癌的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究通過一系列體外實(shí)驗(yàn)確定了Linc00152對胰腺癌生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默Linc00152可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲和遷移，機(jī)制可能與vimentin和N-cadherin的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。