呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷小鼠血清EMPs和NGAL的變化及意義*

何丙寅，周強(qiáng)**，段鵬，楊震

(1.武漢市金銀潭醫(yī)院 麻醉科，湖北 武漢 430000; 2.襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 襄陽(yáng) 441000)

機(jī)械通氣(mechanical ventilation,MV)是臨床上用于危重癥患者治療的主要方法[1]。其治療機(jī)制是通過提高氧輸送保護(hù)肺臟，起到維持氣道通氣順暢、改善通氣及氧合、防止機(jī)體缺氧及二氧化碳蓄積等作用[2]。但是有部分患者進(jìn)行MV后出現(xiàn)了不同程度的肺損傷[3]，有研究指出，中性粒細(xì)胞及其介質(zhì)參與呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)的發(fā)生與形成[4]。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)是一種分泌蛋白，在肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中具有靶向效應(yīng)，可直接影響肺部炎癥指標(biāo)的表達(dá)水平，在VILI的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[5]。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與功能障礙是肺損傷的主要因素，內(nèi)皮細(xì)胞微粒(endotheli al microparticles,EMPs)是內(nèi)皮細(xì)胞激活與凋亡時(shí)表面釋放的微囊泡，具有內(nèi)皮細(xì)胞的抗原特性，能夠反映內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，并參與炎癥、血管損傷及血栓的形成[6]。因此，對(duì)EMPs及NGAL在VILI中的變化及意義進(jìn)行研究，能為VILI的發(fā)病機(jī)制及治療提供參考。本研究選取40只昆明種小鼠，采用不同的機(jī)械通氣策略建立4種不同的VILI模型，比較造模通氣2 h時(shí)小鼠血清中EMPs、NGAL水平，分析EMPs、NGAL對(duì)肺損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，10～13周齡、體質(zhì)量22～26 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。小鼠均在控制條件下飼養(yǎng)，12 h光暗周期交替，給予無菌水及標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。本研究獲得醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并通過。

1.2方法

1.2.1小鼠VILI模型建立 使用北京華業(yè)寰宇化工有限公司生產(chǎn)的戊巴比妥鈉對(duì)麻醉(劑量65 mg/kg)小鼠后切開氣管、插入氣管導(dǎo)管，將小鼠放置仰臥位于Buxco動(dòng)物生理信號(hào)采集系統(tǒng)的動(dòng)物倉(cāng)內(nèi)，連接容量控制型小動(dòng)物呼吸機(jī)。根據(jù)不同的機(jī)械通氣策略隨機(jī)將小鼠分為5組(每組8只)：(1)高吸氣末峰壓(high peak inflation pressure,H-PIP)組，小鼠連接呼吸機(jī)后，給予50 cmH2O 氣道峰壓(product placement,PIP)與2.5 cmH2O呼氣末正壓(positive end-expiratory pressure,PEEP)，呼吸頻率17 次/min、潮氣量為1 mL，通氣2 h；(2)低吸氣末峰壓(low peak inflation pressure, L-PIP)組，小鼠連接呼吸機(jī)后給予15 cmH2O PIP，0 cmH2O PEEP，呼吸頻率120 次/min、潮氣量為0.29 mL，通氣2 h；(3)大潮氣量(high volume, HV)組，小鼠連接呼吸機(jī)后，給予30 mL/kg、0 cmH2O PEEP，呼吸頻率65 次/min，通氣2 h；(4)小潮氣量(low volume, LV)組，小鼠連接呼吸機(jī)后，給予6 mL/kg、5 cmH2O PEEP，呼吸頻率135 次/min，通氣2 h；(5)對(duì)照組切開小鼠氣管后，自主呼吸2 h。

1.2.2血清EMPs和NGAL水平 EMPs水平測(cè)定：取小鼠頸動(dòng)脈血500 μL，1 000 r/min離心5 min獲得富血小板血漿，隨后3 000 r/min離心10 min獲得貧血小板血漿，取貧血小板血漿50 μL，加入藻紅蛋白熒光標(biāo)記的抗CD144抗體5 μL、混勻，室溫下避光孵育25 min，完成后分別加入濃度1×109個(gè)/L的絕對(duì)計(jì)數(shù)微球50 μL和磷酸鹽緩沖液1 000 mL，混勻后使用流式細(xì)胞儀對(duì)EMPs水平進(jìn)行檢測(cè)。EMPs定義為直徑<1 μm、CD144陽(yáng)性，讀取10 000個(gè)絕對(duì)技術(shù)微球，計(jì)算CD144陽(yáng)性EMPs數(shù)。NGAL水平測(cè)定：取小鼠眼球外周血0.6 mL，4 ℃環(huán)境下放置過夜后，5 000 r/min離心30 min，取上清液，每管分裝100 μL，放置于-70 ℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)NGAL水平進(jìn)行測(cè)定。

1.3觀察指標(biāo)

比較造模通氣2 h時(shí)5組小鼠血清EMPs、NGAL水平，采用Pearson相關(guān)性分析EMPs與NGAL間的相關(guān)性。記錄4組接受MV小鼠的肺損傷嚴(yán)重程度，根據(jù)肺損傷嚴(yán)重程度將小鼠分為輕度損傷組、中度損傷組及重度損傷組，采用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC曲線)下面積(AUC)評(píng)價(jià)EMPs、NGAL對(duì)重度肺損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值。肺損傷評(píng)分：麻醉狀態(tài)下處死小鼠，取肺葉組織用4%多聚甲醛溶液固定，參考文獻(xiàn)[7]關(guān)于肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由專業(yè)病理科醫(yī)師對(duì)小鼠肺損傷情況進(jìn)行評(píng)分，1～4分為輕度損傷、5～8分為中度損傷及9～12分為重度損傷。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1小鼠血清EMPs及NGAL水平

造模通氣2 h時(shí)，5組小鼠血清EMPs、NGAL水平比較，高吸氣末峰壓組>低吸氣末峰壓組>大潮氣量組及小潮氣量組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大潮氣量組與小潮氣量組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2血清EMPs與NGAL水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，小鼠血清EMPs水平與NGAL水平有正相關(guān)關(guān)系(r=0.515，P=0.003)。見圖1。

2.34組接受MV小鼠的肺損傷程度

結(jié)果顯示，高吸氣末峰壓組輕度損傷發(fā)生率低于低吸氣末峰壓組、大潮氣量組、小潮氣量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高吸氣末峰壓組重度損傷發(fā)生率高于低吸氣末峰壓組、大潮氣量組、小潮氣量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組中度損傷發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 造模通氣2 h時(shí)5組小鼠血清EMPs和NGAL水平比較

圖1 造模通氣2 h時(shí)小鼠血清EMPs水平與NGAL水平的散點(diǎn)圖

表2 4組接受MV小鼠的肺損傷程度比較

2.4不同程度肺損傷小鼠血清EMPs、NGAL水平

結(jié)果顯示，造模通氣2 h時(shí)，輕度損傷組小鼠血清EMPs水平低于中度損傷組及高度損傷組，中度損傷組低于高度損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度肺損傷組小鼠血清NGAL水平低于重度損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度損傷組與中度損傷組小鼠血清NGAL水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同程度肺損傷小鼠EMPs和NGAL水平比較

2.5血清 EMPs和NGAL水平對(duì)重度肺損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，EMPs、NGAL預(yù)測(cè)小鼠重度肺損傷的AUC=0.769、0.763；將EMPs、NGAL納入Logistic回歸分析，根據(jù)回歸結(jié)果中的回歸系數(shù)值計(jì)算得出聯(lián)合數(shù)據(jù)顯示，2項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)小鼠重度肺損傷的AUC=0.910，預(yù)測(cè)重度肺損傷價(jià)值較高。根據(jù)最佳臨界值，當(dāng)血清EMPs>19.24個(gè)/μL時(shí)，其敏感度為95%，特異度為61.5%；當(dāng)NGAL>30.46 μg/L 時(shí)，其敏感度為66.7%，特異度為96.2%；2項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷重度肺損傷的敏感度為98%，特異度為76.9%。見表4和圖2。

3 討論

MV是治療呼吸窘迫綜合征不可缺少的手段，也是導(dǎo)致肺損傷與加重肺損傷的主要原因[8-9]。1974年有學(xué)者對(duì)小鼠進(jìn)行MV實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)肺泡破裂與氣胸、縱膈氣腫的發(fā)生率較高[10]。隨后醫(yī)學(xué)界將MV導(dǎo)致的肺損傷定義為VILI，其發(fā)生的主要機(jī)制可能是因機(jī)械的過度刺激，導(dǎo)致肺細(xì)胞內(nèi)炎癥與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，以至各類炎性因子表達(dá)升高，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞于肺組織處聚積，形成肺損傷[11-12]。

表4 小鼠血清EMPs和NGAL水平對(duì)重度肺損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 血清NGAL、Emps水平檢測(cè)及2項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)重度肺損傷的ROC曲線

本研究中采用通氣模式的高吸氣末峰壓組、低吸氣末峰壓組、大潮氣量組及小潮氣量組小鼠血清EMPs和NGAL水平高于對(duì)照組，這表明無論何種MV都可導(dǎo)致小鼠血清EMPs和NGAL表達(dá)水平升高，這與研究文獻(xiàn)[13-15]的結(jié)果基本一致；且證明EMPs和NGAL可能參與了小鼠VILI的發(fā)生。EMPs是內(nèi)皮細(xì)胞在激活與凋亡狀態(tài)下釋放的物質(zhì)，可作為一種炎性介質(zhì)與黏附分子的效應(yīng)載體，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，加重內(nèi)皮功能損害[16-17]。EMPs還可引起細(xì)胞炎性介質(zhì)瀑布樣釋放，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集合髓過氧化酶的釋放，破壞肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞，造成肺損傷。NGAL升高是發(fā)生VILI的一個(gè)重要特征，NGAL主要來自中性粒細(xì)胞[18-19]。中性粒細(xì)胞激活導(dǎo)致血清NGAL水平升高，而機(jī)械刺激對(duì)呼吸道造成損傷，誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)促使NGAL表達(dá)升高，進(jìn)一步刺激肺部組織，導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)EMPs和NGAL水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這表明2者會(huì)隨著其中1項(xiàng)指標(biāo)的升高而升高，下降而下降；因此小鼠肺損傷的發(fā)生，應(yīng)該是EMPs與NGAL共同作用所導(dǎo)致。另外，本研究進(jìn)行MV的高吸氣末峰壓、低吸氣末峰壓、大潮氣量及小潮氣量4組小鼠，其在輕度肺損傷與重度肺損傷之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這應(yīng)該與采取的通氣方式及通氣時(shí)參數(shù)的不同有關(guān)；因此臨床中需合理選擇通氣模式與通氣相關(guān)參數(shù)，這應(yīng)該是減少VILI的關(guān)鍵。但本研究納入樣本量相對(duì)較少，因此還需進(jìn)一步分析研究，何種通氣模式與通氣相關(guān)參數(shù)更易導(dǎo)致VILI的發(fā)生。本研究將小鼠處死后，對(duì)其肺損傷程度進(jìn)行分析顯示，隨著肺損傷程度的升高，小鼠EMPs與NGAL水平會(huì)出現(xiàn)升高，但重度損傷與中度損傷小鼠NGAL指標(biāo)并無差異，這應(yīng)該與樣本量偏少有關(guān)。經(jīng)ROC曲線分析顯示：EMPs與NGAL對(duì)重度肺損傷小鼠的AUC=0.769、0.763；預(yù)測(cè)效果一般，將2項(xiàng)檢測(cè)聯(lián)合后AUC=0.910，效果很好。這表明兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)對(duì)重度肺損傷具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，無論采用何種MV方式小鼠均可出現(xiàn)不同程度肺損傷，且EMPs及NGAL會(huì)隨著肺損傷嚴(yán)重程度升高。EMPs與NGAL有望成為診斷VILI的生物指標(biāo)，但需要一步大樣本、多中心研究。