藁本內(nèi)酯通過改善骨骼肌糖利用提高老年小鼠運(yùn)動(dòng)能力

杜旌暢 向長(zhǎng)貞 張紅梅 雷連曼

衰老是人必需面對(duì)的自然演進(jìn)過程。隨著年齡增長(zhǎng)，機(jī)體出現(xiàn)一系列漸進(jìn)性的衰退。骨骼肌是人體最先出現(xiàn)衰老的組織［1］，表現(xiàn)為肌肉力量減退、恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)等。延緩老年人肌肉功能的降低，對(duì)緩解人體衰老有積極意義。藁本內(nèi)酯在傘形科植物中含量豐富，是中國(guó)傳統(tǒng)藥材當(dāng)歸、川芎的重要有效成分。藁本內(nèi)酯具有多樣的藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯對(duì)模擬缺血環(huán)境的血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用［2］。另有研究證實(shí)，藁本內(nèi)酯能夠抑制細(xì)胞炎癥，對(duì)抗心肌組織缺氧損傷［3］。目前，藁本內(nèi)酯對(duì)衰老肌肉組織的作用尚缺乏報(bào)道。本研究采用小鼠爬桿和負(fù)重游泳模型，結(jié)合檢測(cè)肌肉組織相關(guān)因子的表達(dá)，評(píng)價(jià)藁本內(nèi)酯對(duì)衰老小鼠肌肉功能及糖合成、代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠18只，雄性，12月齡，體質(zhì)量（40±5）g；由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于24℃恒溫動(dòng)物房中，光照∶黑暗=14∶10，經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 藁本內(nèi)酯（成都曼思特生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物有限公司）；乳酸測(cè)試盒（南京建成生物有限公司）；總蛋白定量測(cè)定試劑盒（南京建成生物有限公司）；糖原試劑盒（Solarbio）；Anti-GSK-3β蛋白一抗（Cell Signaling Technology）；Anti-GSK3 beta（phosphor S9）蛋白一抗（Abcam）；β-Actin（北京博奧森）；兔二抗（Cell Signaling Technology）；硫酸、甲醇為分析純（成都科龍化工）。

1.3 儀器 高通量電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad）；凝膠化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Rad）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek）；微量勻漿儀（美國(guó) Thermo）；離心機(jī)（美國(guó) Thermo），純水儀（美國(guó) Thermo）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組與給藥：18只小鼠隨機(jī)均等分為對(duì)照組（B組）、藁本內(nèi)酯每日給藥組（LE組）、藁本內(nèi)酯間日給藥組（LD組）3組。藁本內(nèi)酯使用生理鹽水稀釋至2 mg/mL。B組每日灌胃生理鹽水0.3 mL，LE組每日50 mg/kg灌胃藁本內(nèi)酯，LD組單日50 mg/kg灌胃藁本內(nèi)酯、雙日灌胃生理鹽水0.3 mL。所有動(dòng)物每日灌胃1次，共給藥14 d；完成后，于第15天進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)，第16天進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)，第17天取組織進(jìn)行相關(guān)因子的檢測(cè)。

1.4.2 爬桿實(shí)驗(yàn)：將小鼠放在長(zhǎng)50 cm垂直懸空的光滑玻璃棒上端，使小鼠肌肉一直處于緊張狀態(tài)，記錄小鼠在玻璃棒停留至滑落的時(shí)間，累計(jì)測(cè)量3次，記錄每只小鼠爬桿總時(shí)間。

1.4.3 力竭游泳實(shí)驗(yàn)：小鼠尾根部負(fù)荷5%體質(zhì)量的鉛皮塊，置小鼠在水箱中游泳。水箱大小為400 mm×600 mm×400 mm，水深（35±1）cm，水溫（25±2）℃。以小鼠頭部沉入水底10 s不能浮出水面記為體力耗竭，記錄每只小鼠力竭游泳時(shí)間。

1.4.4 組織獲?。盒∈笥诘?7天進(jìn)行非負(fù)重游泳30 min，休息60 min后處死。股動(dòng)脈取血處死小鼠，同時(shí)收集動(dòng)脈血約1000 μL，4℃靜置30 min，離心機(jī)3000 r/min離心10 min后取上清備用；迅速取出動(dòng)物腓腸肌組織約0.3 g于1 mL生理鹽水中，微量勻漿儀中勻漿，進(jìn)行后續(xù)因子的測(cè)定。

1.4.4.1 血清中乳酸、LDH含量測(cè)定：取適量血清使用生理鹽水稀釋后，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作，采用比色法檢測(cè)血清乳酸、LDH水平。

1.4.4.2 肌肉組織中糖原及總蛋白含量測(cè)定：取適量組織勻漿液，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作，采用比色法檢測(cè)肌肉組織中糖原水平，并計(jì)算單位體積總蛋白含量。

1.4.4.3 肌肉組織中糖原合成激酶-3β（GSK-3β）及其磷酸化（p-GSK-3β）水平測(cè)定：采用Western blot法檢測(cè)組織中GSK-3β及p-GSK-3β水平，以β-Actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)含量。按照western蛋白提取試劑盒說明書提取肌肉組織蛋白后分裝保存在-80℃的冰箱待用。將肌肉組織蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜60 min，封閉2 h，加入GSK-3β及其磷酸化蛋白一抗，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠Ig G（1∶3000），孵育，ECL顯影，曝光。采用 Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，GSK-3β與內(nèi)參β-Actin灰度的比值即為GSK-3β的相對(duì)含量，以p-GSK-3β與GSK-3β灰度的比值即為GSK-3β的相對(duì)磷酸化水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠爬桿時(shí)間及力竭游泳時(shí)間的影響 結(jié)果顯示，與B組比較，LE組與LD組小鼠的爬桿時(shí)間、力竭游泳時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），2種給藥方式之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠爬桿及力竭游泳時(shí)間的影響（±s，s，n=6）

表1 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠爬桿及力竭游泳時(shí)間的影響（±s，s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05

組別 爬桿時(shí)間 力竭游泳時(shí)間B 組 63.17±10.42 194.0±32.92 LE 組 84.50±13.72* 296.7±44.36*LD 組 81.83±11.75* 267.3±29.68*

2.2 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠血清中乳酸與LDH含量的影響 與B組比較，LE組與LD組小鼠血清中的乳酸與LDH含量均顯著降低（P＜0.05）；與LD組相比，LE組小鼠血清中的乳酸與LDH含量也均顯著降低（P＜0.05）。見表 2。

表2 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠血清中乳酸、LDH含量的影響（±s，n=6）

表2 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠血清中乳酸、LDH含量的影響（±s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05；與LE組比較，△P<0.05

組別 乳酸（mmol/L） LDH（U/L）B 組 515.2±19.60 615.1±60.19 LE 組 374.0±19.08* 354.7±52.37*LD 組 411.3±26.53*△ 477.9±39.99*△

2.3 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠肌肉組織中糖原、GSK-3β及其磷酸化水平的影響 與對(duì)照組相比，LE組與LD組小鼠組織中糖原含量均顯著升高（P＜0.05），而2種給藥方式之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。3組GSK-3β的總量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但LE組與LD組GSK-3β磷酸化水平較B組顯著增高（P＜0.05），且與LD組相比，LE組GSK-3β的磷酸化水平更高（P＜0.05）。見表 3，圖 1。

表3 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠血清糖原含量的影響（±s，n=6）

表3 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠血清糖原含量的影響（±s，n=6）

注：與B組比較，*P<0.05

組別 糖原含量B 組 0.0682±0.01459 LE組LD組0.1499±0.02235*0.1251±0.01225*

圖1 藁本內(nèi)酯對(duì)小鼠肌肉組織中GSK-3β及其磷酸化水平的影響（±s，n=3）

3 討論

骨骼肌功能退化是衰老的重要表現(xiàn)，老年人衰老不僅表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量下降，肌肉耐力、爆發(fā)力等也會(huì)明顯退化。糖的利用能力對(duì)骨骼肌功能有重要影響，隨著年齡增長(zhǎng)，骨骼肌對(duì)于糖的利用能力也在降低。研究發(fā)現(xiàn)，衰老抑制了骨骼肌表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄，提示其對(duì)細(xì)胞攝取葡萄糖有抑制作用［4］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌利用葡萄糖能力的降低與細(xì)胞胰島素抵抗（IR）狀態(tài)有直接聯(lián)系［5］。改善骨骼肌對(duì)糖的利用，對(duì)于改善衰老肌肉的功能有巨大幫助。

藁本內(nèi)酯具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可對(duì)抗缺血損傷、舒張平滑肌、抑制神經(jīng)炎癥［6-8］。本研究通過爬桿試驗(yàn)和力竭游泳實(shí)驗(yàn)，探討不同給藥頻率下藁本內(nèi)酯對(duì)老年小鼠力量與耐力的影響。結(jié)果顯示，2種藁本內(nèi)酯給藥頻率均能夠顯著提升小鼠力量與耐力，不同給藥頻率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在相關(guān)研究中，有文獻(xiàn)報(bào)道了藁本內(nèi)酯對(duì)C2C12細(xì)胞的凋亡和自噬有抑制作用［9-10］，提示了該藥物對(duì)骨骼肌功能的改善作用，而本研究則首次觀察到藁本內(nèi)酯有明確的提升骨骼肌功能的作用。

在運(yùn)動(dòng)情況下，糖原分解產(chǎn)生乳酸，部分進(jìn)一步氧化為H2O與CO2，未完全氧化的乳酸則進(jìn)入血液，在運(yùn)動(dòng)后會(huì)經(jīng)糖異生途徑重新用于糖原合成。檢測(cè)運(yùn)動(dòng)后血乳酸與組織中糖原的水平，對(duì)于評(píng)價(jià)骨骼肌糖異生能力有重要意義。本研究證實(shí)，經(jīng)藁本內(nèi)酯處理的老年小鼠，運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平更低，而肌糖原表達(dá)更高。這說明藁本內(nèi)酯的確對(duì)骨骼肌的糖異生有促進(jìn)作用。2種不同給藥頻率組間乳酸水平有差異，而糖原增加并沒有差異，這可能與藁本內(nèi)酯能夠舒張血管有關(guān)［11］，局部組織更好的血供有利于乳酸的迅速擴(kuò)散，使得機(jī)體能夠以更高的效率清除乳酸。結(jié)合GSK-3β檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，不同給藥頻率下其磷酸化程度均出現(xiàn)了明顯的升高。因此，藁本內(nèi)酯對(duì)乳酸的降低可能是加快乳酸擴(kuò)散與強(qiáng)化糖異生共同作用的結(jié)果，因此其變化幅度大于糖原的變化。

最后，本研究檢測(cè)了藁本內(nèi)酯對(duì)運(yùn)動(dòng)老年小鼠血LDH的影響，LDH可用于反映運(yùn)動(dòng)引起的組織損傷。在既往研究中，已經(jīng)觀察到藁本內(nèi)酯對(duì)缺血細(xì)胞的膜穩(wěn)定作用［12］，本研究再次在不同模型下驗(yàn)證了藁本內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯能夠提高老年小鼠的力量與耐力，加快乳酸代謝、增強(qiáng)肌糖原合成、抑制力竭運(yùn)動(dòng)引起的血LDH升高，改善老年小鼠骨骼肌功能。該作用在藁本內(nèi)酯中首次發(fā)現(xiàn)，拓寬了其生物學(xué)用途，也為進(jìn)一步使用富含藁本內(nèi)酯的藥物改善老年人骨骼肌功能提供了一定依據(jù)。