橙皮素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響*

李曉杰，覃瑛，周誼霞,2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是目前引起全球因疾病死亡的主要原因，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)作為常見的心血管疾病，是導(dǎo)致心血管病患者死亡的主要因素[1]。As以動(dòng)脈內(nèi)斑塊形成為主要特征，可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈疾病、中風(fēng)和外周血管疾病等多種并發(fā)癥[2]。有文獻(xiàn)表明，As的發(fā)生發(fā)展涉及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、巨噬細(xì)胞極化、泡沫細(xì)胞形成以及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等幾種機(jī)制[3],在這些機(jī)制中，血管平滑肌細(xì)胞 (vascular smooth muscle cell, VSMCs)的表型轉(zhuǎn)化失調(diào)被認(rèn)為是As病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]。在正常生理狀態(tài)下，VSMCs表現(xiàn)出靜止的收縮表型，合成活性低、很少增殖[5]。在炎癥、機(jī)械損傷等病理生理學(xué)條件下，VSMCs表現(xiàn)出增殖表型[5]，具有高增殖和高遷移能力，從而有助于血管壁修復(fù)。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，VSMCs過(guò)度增殖會(huì)導(dǎo)致表型轉(zhuǎn)化失調(diào)，促進(jìn)動(dòng)脈斑塊形成[4]。因此，抑制VSMCs過(guò)度增殖，防止異常的表型轉(zhuǎn)化已被認(rèn)為是防治As的一種治療方法。橙皮素(hesperetin,HES)是一種3′，5′，7-三羥基-4-甲氧基黃烷酮，屬于黃酮類化合物，是柑橘類水果中含量最豐富的黃酮類化合物之一[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HES具有降血糖、降血脂改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6-7]，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立離體模型，觀察HES對(duì)大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs的影響，從VSMCs表型轉(zhuǎn)化的角度探討其可能的機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療As提供一定的實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡健康雄性SD大鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房[合格證號(hào)為SYXK(黔)2018-0001]，1只，體質(zhì)量85 g。

1.1.2主要試劑和儀器 Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12(DMEM ∶F-12)培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國(guó)Clark公司)，血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB；美國(guó)R&D公司)，HES(中國(guó)Macklin公司)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本Dojindo化學(xué)研究所)，兔抗平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-smooth muscle actin，α-SMA)和平滑肌22α(Smooth muscle 22α，SM22α；中國(guó)Proteintech公司)，兔抗彈性蛋白原(elastin，ELN；中國(guó)Affinity公司)，兔抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA；中國(guó)萬(wàn)類生物)，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和抗兔二抗[goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP，武漢Servicebio公司]；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-tek公司)，蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)及凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs的提取 采用組織塊貼壁法提取大鼠原代VSMCs。取SD大鼠，以0.7 mL/kg的劑量腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉；75%酒精消毒皮膚，無(wú)菌環(huán)境下剝離并取出主動(dòng)脈；主動(dòng)脈放入盛有培養(yǎng)基的備用6 cm培養(yǎng)皿中，剝離外膜后用顯微剪中間剖開血管；輕刮內(nèi)膜，剪成1 mm×1 mm組織塊貼于培養(yǎng)瓶底部，均勻分布，加10%FBS 4 mL；培養(yǎng)瓶底部朝上，置于含5%CO2和95%O2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；1.5 h后將培養(yǎng)瓶反過(guò)來(lái)，使組織接觸培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d換液1次，3～5 d可見少量細(xì)胞從組織塊爬出，2周左右長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底部80%，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)與α-SMA的鑒定 取1.2.1項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs置于10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，5%CO2、95%O2及飽和濕度的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d換液1次，取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，按5個(gè)/L密度均勻接種于鋪有爬片的12孔板中，當(dāng)密度長(zhǎng)至70%時(shí)，采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)VSMCs標(biāo)志性因子α-SMA進(jìn)行鑒定。

1.2.3CCK-8法篩選藥物濃度及細(xì)胞分組 將1.2.1項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs按5×106個(gè)/L的密度均勻接種于96孔板，待VSMCs長(zhǎng)至70%時(shí)，血清饑餓24 h，使VSMCs處于生長(zhǎng)靜止期；加入2、5、10、25及50 μg/L PDGF-BB和10、50、100、150、200、250及300 μmol/L HES培養(yǎng)24 h，將CCK-8溶液與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1 ∶9混勻孵育2 h，于450 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)吸光度值篩選出PDGF-BB最佳造模條件和HES最佳干預(yù)濃度；根據(jù)上述結(jié)果將VSMCs設(shè)置為對(duì)照組(0 μg/L PDGF-BB)、造模組(25 μg/L PDGF-BB)及加藥組(25 μg/L PDGF-BB+100 μmol/L HES)，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMCs的細(xì)胞遷移 6孔板提前劃好橫線，每0.5cm劃1條線；取1.2.3項(xiàng)下各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×108個(gè)/L的密度均勻接種于6孔板，待細(xì)胞融合度長(zhǎng)至100%時(shí)用1 mL吸頭垂直于橫線劃1條豎線，PBS清洗2次，血清饑餓24 h；加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/L的HES干預(yù)24 h，顯微鏡下記錄0和24 h的細(xì)胞遷移情況，采用Image J計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.2.5Western blot檢測(cè)VSMCs中α-SMA、SM22α、ELN和PCNA蛋白的表達(dá) 取1.2.3項(xiàng)下各組VSMCs經(jīng)胰酶消化后，按5×108個(gè)/L密度接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)血清饑餓24 h，加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/LHES培養(yǎng)24 h；PBS清洗2次，加RIPA裂解液冰上裂解提取總蛋白；BCA法蛋白定量后，120 V電壓電泳至溴酚藍(lán)跑到膠底部停止，220 mA轉(zhuǎn)膜100 min，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，α-SMA、SM22α、ELN及PCNA一抗4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗3次、10 min/次，二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗3次、10 min/次，ECL發(fā)光液顯影，采用Image J統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)5 d有少量細(xì)胞從組織塊中爬出、貼壁生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)2 d后細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，偶有三角形和星形，有典型的“峰-谷”狀特征；用平滑肌細(xì)胞特異性因子α-SMA對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，平滑肌細(xì)胞純度>95%，高倍鏡下可見與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的肌絲。見圖1。

注：A、B分別為光鏡下原代培養(yǎng)5 d及傳代培養(yǎng)2 d細(xì)胞形態(tài)(200×)，藍(lán)色箭頭指向“峰”、紅色箭頭指向“谷”；C(200×)、D(400×)為第3代培養(yǎng)2 d時(shí)免疫熒光鑒定結(jié)果。圖1 大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Culture and identification of rat primary thoracic aorta VSMCs

2.2 PDGF-BB對(duì)VSMCs的增殖作用

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，PDGF-BB處理24 h后VSMCs的活性呈濃度依賴性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01，圖2A)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，25、50及100 μg/L組VSMCs的α-SMA和SM22α的蛋白表達(dá)水平分別明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但3組PDGF-BB比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2B和2C)，因此選擇25 μg/L的PDGF-BB濃度作為體外造模的干預(yù)濃度。

注：A為CCK-8檢測(cè)結(jié)果，B為Western Blot檢測(cè)結(jié)果，C為蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；與空白對(duì)照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.001。圖2 不同濃度PDGF-BB對(duì)VSMCs的細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of different concentrations of PDGF-BB on cell proliferation of VSMCs

2.3 HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖的作用

CCK-8檢測(cè)不同濃度HES對(duì)PDGF-BB刺激VSMCs增殖活性的影響，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，造模組VSMCs增殖活性增強(qiáng)(P<0.001)；與造模組比較，除了濃度為10 μmol/L HES組外(P>0.05)，其余HES干預(yù)組VSMCs增殖活性均受到抑制(P<0.001)；當(dāng)HES濃度≥100 μmol/L時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇濃度為100 μmol/L的HES作為加藥組的干預(yù)濃度。見圖3。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖3 不同濃度HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖活性的影響Fig.3 The effects of different concentrations of hesperetin on the viability of VSMCs induced by PDGF-BB

2.4 HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，造模組VSMCs遷移率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與造模組比較，加藥組VSMCs遷移率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖4。

2.5 α-SMA和SM22α蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，造模組VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與造模組比較，加藥組VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖5。

2.6 ELN和PCNA蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，造模組VSMCs合成表型因子ELN和PCNA蛋白表達(dá)水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與造模組比較，加藥組VSMCs的ELN、PCNA蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖6。

3 討論

據(jù)報(bào)道，CVD目前占所有死亡人數(shù)的40%以上[8]，As斑塊的形成與破裂是導(dǎo)致CVD患者死亡的主要因素[9]。本課題組在前期研究中對(duì)臨床血管性疾病人群進(jìn)行了大數(shù)據(jù)的采集與統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明動(dòng)脈血管的僵硬度與血流順應(yīng)性和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)存在著明顯的相關(guān)性[10]。血流動(dòng)力學(xué)改變最先累及血管壁，血管壁損傷及血管內(nèi)膜過(guò)度增生，最終會(huì)導(dǎo)致血管壁硬化、As形成，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致As斑塊破裂，引發(fā)急性CVD[11]。目前對(duì)As斑塊形成與破裂的機(jī)制研究存在多種觀點(diǎn)，其中VSMCs的表型轉(zhuǎn)化失調(diào)被認(rèn)為是As病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，高達(dá)70%的As病變與VSMCs表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[12]。病理狀態(tài)下，由于動(dòng)脈血管分泌過(guò)多的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子和趨化因子以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，會(huì)導(dǎo)致中膜的VSMCs過(guò)度增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化失調(diào)，參與As的發(fā)生發(fā)展[13]。因此，開發(fā)抑制VSMCs遷移、增殖及表型轉(zhuǎn)化的方法已成為As研究中的一個(gè)迫切問(wèn)題。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖4 HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力的影響Fig.4 The effect of hesperetin on PDGF-BB induced VSMCs migration

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖5 HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs α-SMA和SM22α 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of hesperetin on VSMCs α-SMA and SM22α protein expression induced by PDGF-BB

注：與對(duì)照組比較，(1)P<0.001，與造模組比較，(2)P<0.001。圖6 HES對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs ELN和PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of hesperetin on the expression levels of ELN and PCNA induced by PDGF-BB

探究VSMCs功能常用的細(xì)胞有原代細(xì)胞和細(xì)胞株2種，已有研究表明VSMCs細(xì)胞株隨著傳代次數(shù)增加，其固有的生理學(xué)特征往往會(huì)發(fā)生改變，不能很好地模擬體內(nèi)生理狀態(tài)，不利于As的深入研究[14]。為了保證VSMCs的性狀和生物學(xué)特性接近預(yù)期生理狀態(tài)，有學(xué)者于20世紀(jì)70年代提出分離原代VSMCs的方法[15]。VSMCs的原代培養(yǎng)方法有酶消化法和組織塊貼壁法，因前者存在價(jià)格昂貴、消化時(shí)間和配比濃度不好把控、細(xì)胞獲得量少及活性差的缺點(diǎn)[16-18]，故本研究采用組織塊貼壁法提取SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs[19]。本研究原代細(xì)胞的提取過(guò)程中，將外膜剝離干凈，刮去內(nèi)膜，避免了內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染，確保了原代VSMCs的純度；細(xì)胞分離與培養(yǎng)過(guò)程中，為了提高VSMCs的獲得率和純度，要注意以下幾點(diǎn)：(1)為保證VSMCs的穩(wěn)定性和生命力，選取4周齡身體健康的SD大鼠作為研究對(duì)象；(2)為提高VSMCs的活性，不可過(guò)度牽拉血管；剪組織的剪刀要盡可能鋒利，使組織塊邊緣平整；(3)為了防止污染，全程應(yīng)注意無(wú)菌操作；(4)原代培養(yǎng)前3天要絕對(duì)靜置，不用換液。本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs體外培養(yǎng)模型，采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法對(duì)VSMCs進(jìn)行鑒定，純度>95%，傳代培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇后，細(xì)胞仍然比較穩(wěn)定，為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。

PDGF能夠調(diào)節(jié)血管形成，PDGF家族由5種類型或同源二聚體組成，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC及PDGF-DD[20-21]。PDGF-BB被認(rèn)為是VSMCs從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的最有效的刺激劑之一[22]。外源性PDGF-BB能刺激VSMCs分裂和增殖，加速細(xì)胞外基質(zhì)和膠原的形成，從而縮短愈合時(shí)間[23-24]。本研究采用PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖模型，CCK-8結(jié)果表明PDGF-BB處理后VSMCs增殖活性明顯增加。有研究表明，PDGF-BB是VSMCs分裂所必需的元素，本質(zhì)上PDGF-BB允許VSMCs跳過(guò)G1檢查點(diǎn)進(jìn)行分裂,在傷口愈合中扮演著重要的作用[25]。本研究中劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 PDGF-BB能夠顯著增強(qiáng)VSMCs的遷移能力。

VSMCs含有1組特殊的細(xì)胞骨架蛋白，這些蛋白通常與細(xì)胞收縮有關(guān)，通常用作跟蹤內(nèi)膜增生、管腔狹窄以及As中發(fā)生的表型變化的標(biāo)志物[26]。VSMCs最普遍的標(biāo)志是α-SMA，這是典型的VSMCs肌動(dòng)蛋白亞型，α-SMA在VSMCs中表達(dá)，即使在發(fā)育的早期也是如此[27]。其他常用的細(xì)胞骨架蛋白還包括SM22α、Calponin及非肌肉肌球蛋白重鏈亞型A和B[28]。然而合成表型的識(shí)別主要依賴于成熟或分化表型的細(xì)胞骨架標(biāo)志物，其表達(dá)減少或缺失及增殖相關(guān)標(biāo)志物(ELN和PCNA)的高表達(dá)。以往研究中，PDGF-BB通常被用來(lái)誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB抑制了VSMCs收縮表型標(biāo)志因子α-SMA和SM22α蛋白的表達(dá)，增加了合成表型ELN和PCNA蛋白的表達(dá)，表明PDGF-BB促進(jìn)了VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化。

HES是從柑橘、柚子及檸檬等蕓香科中分離得到的天然黃酮類化合物[30]。已有研究證明HES具有明顯的抗氧化、抗炎及抗增殖作用[31-32]。Jeong等[33]在動(dòng)物高脂飼料中添加0.05% HES衍生物，喂飼10 d后發(fā)現(xiàn)HES衍生物具有明顯的降血脂作用；Jayarman等[6]研究發(fā)現(xiàn)HES對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有降血糖、抗氧化和降血脂的作用，表明服用HES后可通過(guò)改善大鼠的抗氧化能力來(lái)減輕高血糖和血脂異常；Sugasawa等[7]實(shí)驗(yàn)表明，HES對(duì)APOE-/-小鼠As進(jìn)展具有保護(hù)作用。本研究將HES應(yīng)用于PDGF-BB刺激的VSMCs中，發(fā)現(xiàn)HES抑制了PDGF-BB對(duì)VSMCs的促增殖作用和促遷移作用；Western Blot結(jié)果表明加入HES后VSMCs收縮表型標(biāo)志因子α-SMA及SM22α蛋白的表達(dá)上升，合成表型標(biāo)志因子ELN和PCNA蛋白的表達(dá)下降，表明HES成功逆轉(zhuǎn)了PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化這一過(guò)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HES可以明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMCs的增殖和遷移，增加收縮表型標(biāo)志蛋白α-SMA和SM22α的表達(dá)，降低合成表型標(biāo)志蛋白ELN和增殖蛋白PCNA的表達(dá)。由此可認(rèn)為，HES可以通過(guò)抑制VSMCs從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化，從而逆轉(zhuǎn)As的發(fā)生發(fā)展，可為As基礎(chǔ)防治提供新的參考依據(jù)。