全自動免疫組化預處理儀在改良EBER原位雜交檢測中的應用

林 蓁，楊文圣

EB病毒(EB virus, EBV)，全世界約95%的成人攜帶此病毒，其與許多腫瘤性疾病及非腫瘤性疾病關(guān)系密切，其中EBV相關(guān)淋巴組織疾病更是病理診斷中較為困難的領域。EB病毒檢測不同方法可能檢測結(jié)果會有所差異，我們選擇原位雜交方法，其主要優(yōu)點在于原位，可以對靶序列進行組織、細胞的空間定位。原位雜交檢測具有敏感性高、特異性強、定位清晰，是目前較公認檢測EBV的金標準。如何在現(xiàn)有實驗室條件，做好質(zhì)控顯得十分必要。本科室對傳統(tǒng)方法進行改良，節(jié)省了檢測時間，實驗效果更佳，結(jié)果更加穩(wěn)定，現(xiàn)分享如下。

1 材料與方法

1.1 材料隨機選取2017年1月～2019年1月送廈門大學附屬成功醫(yī)院病理科檢測EBER的組織90例。

1.2 試劑與儀器EBER試劑盒(泰普生物中國公司)、EDTA組織修復液(pH 9.0，Dako公司)、PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)、全自動免疫組化預處理儀(PT200，Dako公司)、電熱恒溫箱、徠卡切片機。

1.3 方法(1)切片與脫蠟：石蠟組織3 μm厚切片，黏附2張潔凈防脫載玻片上均分2組，65 ℃烤片30 min。二甲苯3 min×2，無水乙醇3 min×2，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，流水3 min。(2)預處理、變性、雜交：①傳統(tǒng)方法，預處理、變性、雜交：蛋白酶K消化5 min、55 ℃孵育變性60 min、37 ℃恒溫雜交過夜。②改良方法，預處理：將EDTA(50×)修復液裝入全自動免疫組化預處理儀中，開啟預處理程序加熱預溫到85 ℃后，將切片浸沒入修復液中，繼續(xù)預處理程序，進行98 ℃ 20 min的組織滲透；程序結(jié)束，取出切片PBS緩沖液3 min，蒸餾水1 min；變性、雜交：根據(jù)組織大小移液15～20 μL適量雜交液，加潔凈蓋玻片覆蓋組織切面。切片水濕盒55 ℃恒溫孵育變性60 min取出；放置裝雜交增強液的孵育盒，37 ℃恒溫雜交60 min。(3)免疫顯色、切片復染：切片小心移去蓋玻片，放置加熱至48～50 ℃ PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩，拭去組織周邊緩沖液，滴加一抗50 μL，37 ℃水濕盒孵育30 min；取出切片37 ℃ PBS緩沖液3 min×2，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加二抗50 μL，室溫孵育20 min；取出切片PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加HRP 50 μL，室溫水濕盒孵育30 min；取出切片，PBS緩沖液2 min×3，充分搖蕩。拭去組織周邊緩沖液，滴加適量新鮮配置DAB顯色2 min左右，顯微鏡下控制時間。切片蘇木精適度復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判定實驗結(jié)果判讀，組織細胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯棕褐色顆粒即判為陽性，未出現(xiàn)棕褐色顆粒判為陰性。

2 結(jié)果

90例檢測EBER組織中，傳統(tǒng)方法陽性檢出37例、陰性53例；改良方法陽性檢出39例、陰性51例(表1)。兩組檢測陰性、陽性結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P=0.763)。改良方法：陰性病例背景干凈無表達，陽性病例信號表達強、明顯清晰(圖1)；陽性信號拷貝數(shù)少信號弱的病例，陽性信號仍清晰可辨(圖2)。

表1 改良與傳統(tǒng)原位雜交檢測EBER結(jié)果對比[n(%)]

①②

3 討論

原位雜交方法檢測石蠟包埋組織中EBER，對組織進行適當預處理，使組織通透性增強，易于已知標記探針進入細胞內(nèi)與待測靶mRNA雜交，操作中存在各種影響因素，想要做好質(zhì)控，組織滲透環(huán)節(jié)十分關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法常首選蛋白酶K，亦有選擇胃酶增強組織通透性的[1]，這種廣泛去蛋白作用在增強組織通透性和核酸探針穿透性，提高雜交信號的同時，也會使靶核酸減少，對組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)也有一定的影響，所以在通透組織的試劑用量和時間上都要有較好的掌握[2]。消化不足組織核酸暴露不充分，陽性信號減弱或不顯示。消化過度核酸周圍組織的蛋白結(jié)構(gòu)會被破壞，在接下來的實驗中核酸易丟失呈假陰性或陽性信號減弱[3]。

有文獻報道[4]將高壓熱修復用于石蠟包埋組織原位雜交修復。啟發(fā)我們對增強組織通透性環(huán)節(jié)進行改良，實驗表明改良效果甚好。推論其原理可能是對組織進行高溫熱滲透預處理時，可以使組織細胞周圍蛋白通路打開，增加組織通透性較好促進了探針滲透，充分與待測的靶mRNA雜交。

改良法可以對組織進行單獨或批次的預處理。滿足特殊組織要求，標本量多時更具優(yōu)勢，提高工作效率。Dako的EDTA修復液還具有脫蠟作用，二次脫蠟確保組織脫蠟完全，更易探針充分滲透；預處理溫度不超過100 ℃，不容易引起組織切片掉片；儀器自動恒溫加熱不必擔心修復液濃度變化、干涸等不良現(xiàn)象；且溫度圖譜可視具體溫度量化值，做到實時監(jiān)測。整個預處理過程可控、快捷、穩(wěn)定，定奠了后續(xù)原位雜交質(zhì)量的保證。

目前試劑盒多采用地高辛標記探針，雜交需4～16 h甚至過夜。改良法，滲透效果得到更好保證，使之后組織細胞中靶mRNA與探針充分接觸，雜交所需時間縮短到1 h，整個實驗流程只需4～5 h?？膳cVentana全自動免疫組化儀EBER原位雜交檢測需要時間相近，較傳統(tǒng)方法時間大大減少，亦同樣取得很好結(jié)果。

Dako全自動免疫組化預處理方法，目前本組病例數(shù)有限，實驗也可能還存在瑕疵，但改良效果明顯。與傳統(tǒng)酶消化滲透方法檢測結(jié)果無明顯差異，陽性率基本一致；陽性信號表達更清晰可辨；特別在陽性拷貝數(shù)較低的病例更具優(yōu)勢。Dako全自動控制的預處理滲透程序，整體流程省時、便捷，檢測結(jié)果穩(wěn)定，改良法是一種值得推薦的病理實驗室檢測EBER的方法。