新型高通量體外藥敏檢測(cè)技術(shù)在復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血病患者個(gè)體化用藥中的應(yīng)用

吳海兵 ，趙曉燕，沈明芳，黃瑞，陳程，任濤，沈旸

0 引言

精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，腫瘤靶向功能基因圖譜和抗癌藥物敏感度之間的關(guān)聯(lián)大數(shù)據(jù)對(duì)腫瘤治療發(fā)揮著重要作用，其中抗癌藥物敏感度數(shù)據(jù)較難獲取。傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)以及類器官（patient derived organoid,PDO）、異種移植瘤小鼠模型（patient derived xenograft,PDX）等單次只能檢測(cè)5～10種藥物，培養(yǎng)成功率低，不足以克服臨床腫瘤患者耐藥的問題。新型高通量體外藥敏實(shí)驗(yàn)（high-throughput drug sensitivity,HDS）是一種基于改良型細(xì)胞條件重編程技術(shù)（conditional reprogramming,CR）的可再生原代癌細(xì)胞藥敏檢測(cè)技術(shù)，一次可檢測(cè)上百種藥物，為精準(zhǔn)治療提供了一個(gè)有利的工具。近年來(lái)，新型原代癌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)臨床研究成為熱點(diǎn)，美國(guó)哈佛大學(xué)、芬蘭赫爾辛基大學(xué)、新加坡中央醫(yī)院、韓國(guó)首爾三星醫(yī)療中心、瑞典烏普薩拉大學(xué)等都在研究相關(guān)技術(shù)體系[1-4]。

復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）整體化療緩解率較低，臨床治療策略十分有限，指南多推薦加入臨床試驗(yàn)或采用新型的組合方案進(jìn)行挽救性化療，然而盲目試藥效果往往差強(qiáng)人意，最終導(dǎo)致不良預(yù)后。如何制定復(fù)發(fā)難治性AML個(gè)性化用藥方案來(lái)提高治療緩解率是臨床熱點(diǎn)探討并亟待解決的難題。Tyner等[5]對(duì)562例AML患者進(jìn)行122種藥物的原代細(xì)胞體外藥敏檢測(cè)，證明藥敏檢測(cè)可用于指導(dǎo)AML臨床用藥，并建立Vizome數(shù)據(jù)庫(kù)，為AML的治療提供了新的工具。本研究旨在探討HDS技術(shù)在復(fù)發(fā)難治性AML患者個(gè)性化用藥治療中的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及一般資料

患者入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)治療兩個(gè)療程無(wú)效的初診病例；（2）完全緩解后經(jīng)過鞏固強(qiáng)化治療，12月內(nèi)復(fù)發(fā)者；（3）12月后復(fù)發(fā)經(jīng)常規(guī)化療無(wú)效者；（4）兩次或多次復(fù)發(fā)者；（5）髓外白血病持續(xù)存在者。共納入19例患者，均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與處理

無(wú)菌條件下采集骨髓4 ml置于EDTA抗凝管，于2℃～8℃冷藏保存運(yùn)輸至中科普瑞昇實(shí)驗(yàn)室。樣本接收后采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，采用中科普瑞昇完全培養(yǎng)液（complete medium,CM）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，CM重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。

1.3 高通量藥板制作

將待測(cè)藥物溶于DMSO中，按照相關(guān)臨床劑量對(duì)應(yīng)的100%血漿峰濃度PPC配置藥物，儲(chǔ)存于24×16的384孔透明藥板（Corning,USA），同時(shí)采用同等體積的DMSO溶劑作為空白對(duì)照。待測(cè)藥物與臨床劑量及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)濃度（實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)請(qǐng)掃描本文OSID碼查看附件）。

1.4 試劑與儀器

Celltiter-Glo細(xì)胞增殖熒光檢測(cè)試劑（Promega,USA）；白血病細(xì)胞完全培養(yǎng)基（中科普瑞昇）。PerkinElmer自動(dòng)移液工作站；PerkinElmer Envision酶標(biāo)儀；BioTek自動(dòng)分液系統(tǒng)；Corning 384孔細(xì)胞培養(yǎng)板；Beckman高速離心機(jī)。

1.5 HDS高通量體外藥敏檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[6]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（1500個(gè)/孔）接種于24×16的384孔白色不透明細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning 3570,USA），每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液50 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用高通量自動(dòng)移液系統(tǒng)（JANUS@automated workstation）給細(xì)胞板加藥（每孔0.1 μl），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo細(xì)胞增殖熒光檢測(cè)試劑，靜置10 min，酶標(biāo)儀Envision Plate-Reader讀數(shù)，得出對(duì)應(yīng)的每孔熒光值RLU。待測(cè)化合物原始數(shù)據(jù)RLUDrug與DMSO對(duì)照組RLUD-MSO進(jìn)行預(yù)處理，即扣除背景熒光值后進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算待測(cè)藥物對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，抑制率（%）=（1－藥物篩選組腫瘤細(xì)胞存活數(shù)目/空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞存活數(shù)目）×100%。

1.6 結(jié)果判定

參考根據(jù)藥物抑制率，分為高度敏感（+++）：抑制率≥80%；中度敏感（++）：抑制率50%～80%；低度敏感（+）：抑制率20%～<50%；不敏感（-）：抑制率<20%。臨床化療療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7]，根據(jù)骨髓象緩解情況，分為完全緩解（CR）、部分緩解（CR）、未緩解（NR）。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效分析

19例患者對(duì)32種藥物和方案的敏感度見圖1，可見不同的患者對(duì)腫瘤藥物的敏感度存在較大差異，這與腫瘤的生物學(xué)特性、患者個(gè)體差異、藥物本身的不良反應(yīng)等因素有關(guān)，而這些因素靠經(jīng)驗(yàn)治療具有一定的盲目性，因此，在化療前針對(duì)不同的患者進(jìn)行體外藥敏篩查來(lái)提高用藥有效性十分必要。本研究利用新型高通量藥敏檢測(cè)技術(shù)，對(duì)19例復(fù)發(fā)難治性AML患者進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇敏感方案進(jìn)行個(gè)性化用藥治療并觀察臨床效果，見表1，其中4例未緩解（NR），4例完全緩解（CR），11例部分緩解（PR），總緩解率ORR為78.94%。

2.2 復(fù)發(fā)難治性AML藥物敏感度分級(jí)

在中高度敏感等級(jí)里，化療方案DAE、DAC、HAD、HD-DA以及單藥高劑量阿糖胞苷、柔紅霉素、米托蒽醌等出現(xiàn)頻次較多。DAE、DAC、HAD、HD-DA方案敏感頻次在68%以上，見圖2，值得進(jìn)一步探討這些方案單獨(dú)以及聯(lián)合靶向治療在復(fù)發(fā)難治性AML患者中的臨床治療價(jià)值。低劑量阿糖胞苷（10 mg/m2）、高三尖杉酯堿（1 mg）、全反式維甲酸、地西他濱、索拉菲尼、CAG等藥物和方案均不敏感，見圖3，其中低劑量阿糖胞苷與高三尖杉酯堿對(duì)復(fù)發(fā)難治性AML患者存在劑量依賴性。綜上所述，高通量藥敏檢測(cè)結(jié)果能夠?yàn)樘厥獍┓N患者在缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)下提供用藥參考，減少無(wú)效用藥，并對(duì)敏感頻次較高的方案進(jìn)行進(jìn)一步劑量探討和臨床試驗(yàn)。

3 討論

圖1 32種藥物/方案對(duì)19例AML患者的抑制率和敏感分級(jí)Figure 1 Inhibition rate and sensitivity grade of 19 AML patients to 32 drugs and regimens

隨著2003年人類基因組計(jì)劃的完成，基于基因檢測(cè)技術(shù)的臨床診療已經(jīng)歷了十多年的發(fā)展，尤其為腫瘤診療領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)基因靶向治療的變革。美國(guó)統(tǒng)計(jì)了2006～2018年涵蓋38種癌癥的基因靶向治療獲益情況，結(jié)果顯示僅8.33%的患者適合基因檢測(cè)，而整體獲益率不到5%[8]，為了應(yīng)對(duì)基因檢測(cè)技術(shù)在可靠性、重復(fù)性、有效性方面的不足，后基因組時(shí)代，人們開始嘗試將體外藥敏檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等表型篩選技術(shù)引入到精準(zhǔn)醫(yī)療解決方案中。2019年CSCO年會(huì)上，賀福初院士的開場(chǎng)主題報(bào)告展示了利用蛋白質(zhì)組學(xué)和PDX藥敏技術(shù)發(fā)現(xiàn)“老藥新用”[9]可解決癌癥“缺藥”的難題，呼吁打破基因組和轉(zhuǎn)錄組的“迷陣”，重視多組學(xué)交叉發(fā)展，特別是表型篩選領(lǐng)域技術(shù)在臨床上的應(yīng)用[10]。杜亞楠等[11-12]通過將腫瘤細(xì)胞系、人源腫瘤異種移植模型（PDX）或腫瘤患者源的原代細(xì)胞接種到3D微陣列上，經(jīng)培養(yǎng)形成3D微腫瘤陣列，與高通量?jī)x器匹配，實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選和個(gè)體化敏感高檢測(cè)，為臨床用藥提供新的技術(shù)支持。劉青松等[13]利用改良型條件重編程技術(shù)[14]開發(fā)了高通量藥物敏感度檢測(cè)體系。

無(wú)論是臨床科學(xué)研究還是臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)正朝著多組學(xué)交叉融合發(fā)展邁進(jìn)，而不僅僅是基因檢測(cè)。如何利用離體腫瘤模型進(jìn)行實(shí)時(shí)腫瘤藥物應(yīng)答監(jiān)測(cè)與評(píng)估將是后基因組時(shí)代重點(diǎn)探討的技術(shù)領(lǐng)域。一個(gè)好的藥敏檢測(cè)技術(shù)需要具備以下幾點(diǎn)：（1）高通量，即單個(gè)周期內(nèi)檢測(cè)的藥物數(shù)量足夠多，只有解決了通量的問題，才能有望應(yīng)對(duì)腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)難治的問題；（2）成本低；（3）操作成功率高；（4）周期短；（5）體內(nèi)外一致性好。目前，小鼠移植腫瘤模型[15]和類器官[16]尚需解決通量和成本問題，基于PDC的藥敏檢測(cè)是當(dāng)下較可行的方法。新型高通量藥敏檢測(cè)克服了傳統(tǒng)藥敏細(xì)胞培養(yǎng)困難和劑量換算的難題，是一種有效的2D篩選體系。本次研究發(fā)現(xiàn)高通量藥敏檢測(cè)可以有效指導(dǎo)復(fù)發(fā)難治性AML患者的個(gè)體化藥物治療，較經(jīng)驗(yàn)治療能大大提高用藥有效率，但本研究樣本數(shù)有限，需更多臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

表1 19例AML患者臨床特征和藥敏結(jié)果Table 1 Clinical features and drug sensitivity results of 19 AML patients

圖2 19例患者對(duì)32種藥物和方案中、高度敏感(抑制率≥50%)頻次的百分比Figure 2 Moderate to high sensitivity(inhibition rate ≥50%) frequency percentage of 19 patients to 32 drugs and regimens

圖3 19例患者對(duì)32種藥物和方案不敏感(抑制率<20%)頻次的百分比Figure 3 Insensitive(inhibition rate <20%) frequency percentage of 19 patients to 32 drugs and regimens