多管發(fā)酵法與濾膜法測定水中糞大腸菌群的對比研究

王朝霞

摘 要：多管發(fā)酵法和濾膜法是我國現(xiàn)有的環(huán)境標準分析方法體系中主要的糞大腸菌群檢測方法。本文通過使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質(zhì)控標樣進行比對檢測，了解2種方法的吻合度，并通過分析檢測過程中的各種影響因素和方法優(yōu)缺點，以判斷2種方法更適合的水質(zhì)檢測。

關鍵詞：多管發(fā)酵法;濾膜法;影響因素;優(yōu)缺點

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

糞大腸菌群是在44.5℃條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌[1]。糞大腸菌群的監(jiān)測是相關環(huán)保標準和環(huán)保工作的需要。我國有9個標準中規(guī)定了濃度限值和排放限值。在我國，多管發(fā)酵法是各級環(huán)境監(jiān)測部門普遍采用的經(jīng)典方法，我國現(xiàn)有的環(huán)境標準分析方法體系中，糞大腸菌群的主要檢測方法為多管發(fā)酵法和濾膜法。本研究旨在將2種方法進行對比，了解2種方法的吻合度和優(yōu)缺點。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

1.1.1 多管發(fā)酵法[2]

將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進入倒管中，指示產(chǎn)氣。44.5℃復發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽3號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，最后產(chǎn)氣的細菌確定為糞大腸菌群。通過查MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。

1.1.2 濾膜法[3]

樣品通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度（44.5℃）下培養(yǎng)24h，膽鹽3號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，糞大腸菌群能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過呈藍色或藍綠色菌落計數(shù)，測定樣品中糞大腸菌群濃度。

1.2 水樣的采集

距水面約10～15cm處采樣，采集樣品盛裝于滅菌的采樣瓶中。

1.3 試劑

1.3.1 多管發(fā)酵法

單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基。

1.3.2 濾膜法

MFC培養(yǎng)基。

1.4 實驗步驟

1.4.1 多管發(fā)酵法

根據(jù)水樣污染程度，確定水樣接種量。將水樣接種到乳糖蛋白胨試管中，在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2h進行初發(fā)酵。輕微振蕩在初發(fā)酵試驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣的試管，用火焰灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)，將培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到裝有EC培養(yǎng)基的試管中，在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2h。培養(yǎng)后立即觀察，導管中產(chǎn)氣證實為糞大腸菌群陽性。根據(jù)陽性管數(shù)查MPN表換算樣品中糞大腸菌群數(shù)。

1.4.2 濾膜法

先估計出適合在濾膜上計數(shù)所使用的體積，然后再取這個體積的1/10和10倍，分別過濾。根據(jù)樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10mL，若接種量<10mL時應逐級稀釋。將樣品充分混勻后抽濾，以無菌水沖洗器壁2～3次。用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養(yǎng)基完全貼緊，將培養(yǎng)皿倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，44.5±0.5℃培養(yǎng)24±2h。計數(shù)陽性菌落。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 水樣檢測結(jié)果

使用IDEXX公司提供的糞大腸菌群質(zhì)控標樣，對濾膜法和多管發(fā)酵法進行方法質(zhì)控，檢測的結(jié)果見表1。由表1可知，濾膜法和多管發(fā)酵法的檢測結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi)。但濾膜法測定的結(jié)果要略低于多管發(fā)酵法測定的結(jié)果。

2.2 實驗過程的影響因素

濾膜法受濾膜孔徑的影響，不能檢測濁度大、非大腸桿菌類細菌密度大的水樣。對于濁度大或污染嚴重的樣品，需先稀釋后再抽濾，但稀釋度越大，誤差越大[4];濾膜法每輪抽濾結(jié)束后，要對抽濾設備充分滅菌，否則會影響后面樣品的檢測結(jié)果。

多管發(fā)酵法初發(fā)酵時，因單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中的接種量僅為1mL，在樣品濃度比較低的情況下，易出現(xiàn)陽性結(jié)果不明顯的發(fā)酵管，需認真觀察，將疑似陽性的初發(fā)酵管也轉(zhuǎn)接進行復發(fā)酵;多管發(fā)酵法培養(yǎng)基分裝滅菌時，發(fā)酵管內(nèi)倒管中的氣泡一定要排盡，否則會在發(fā)酵結(jié)束后的判定時出現(xiàn)假陽性結(jié)果;多管發(fā)酵法吸取不同濃度的稀釋液時，每次必須更換移液管，否則會造成檢測結(jié)果的不準確。

2.3 方法的優(yōu)缺點

多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測的經(jīng)典方法，可用于檢測各種水樣，其它方法的研究都是與多管發(fā)酵法進行準確度和可靠性的比較，但其操作步驟繁瑣，檢測周期長，培養(yǎng)基保存時間短，工作量大，干擾因素多，需要消耗大量的人力和物力的缺點，已經(jīng)不能滿足當前國內(nèi)外的檢測需求。

濾膜法可檢測體積較大的水樣，操作簡單，一次到位，避免操作過程中的二次污染，但稀釋度越大，誤差越大。受孔徑影響，不能檢測濁度大、非大腸桿菌類細菌密度大的水樣。

3 結(jié)論

本實驗使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質(zhì)控標樣，分別用濾膜法和多管發(fā)酵法進行檢測，檢測結(jié)果均在質(zhì)量控制可信度區(qū)間內(nèi)，濾膜法測定的結(jié)果要略低于多管發(fā)酵法測定的結(jié)果。濾膜法操作簡單，一次到位，適合于比較清潔的水質(zhì);而多管發(fā)酵法可適用于各種水質(zhì)。

參考文獻

[1]?張少峰，劉國強，魏春雷.糞大腸菌群檢測方法及研究進展[J].海洋通報，2008（03）：102-106.

[2]HJ347.2-2018，水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 多管發(fā)酵法[S].

[3]HJ 347.1-2018，水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 濾膜法[S].

[4]戴巧容，劉育，李燕.多管發(fā)酵法與濾膜法測定水中糞大腸菌群的探討[J].科技創(chuàng)業(yè)家， 2012（13）：213.

（責任編輯 周康）