柴胡疏肝散輔助治療重度抑郁癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

盧玲 莊勝 陳煒 玉倩 汪順貴 李華霞 刁麗梅

摘 要 目的：研究柴胡疏肝散輔助治療重度抑郁癥（MDD）的潛在分子機制。方法：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法。利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）下載MDD患者基因芯片數(shù)據(jù)集GSE76826，再利用R語言軟件中的limma包篩選出MDD患者樣本中的差異基因。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）篩選柴胡疏肝散的活性成分及其對應(yīng)的靶標(biāo)。通過在線軟件venny 2.1.0對MDD的差異基因和柴胡疏肝散的靶標(biāo)取交集，獲取柴胡疏肝散治療MDD的共同靶標(biāo)基因，然后將共同靶標(biāo)基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。利用BisoGenet插件構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對其進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選核心靶標(biāo)基因，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。結(jié)果：柴胡疏肝散治療MDD的活性成分有139種，包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、豆甾醇等;其作用的核心靶點基因共有8個，包括NR3C2、DPP4、ALOX5、GSTM1、CCND1、IGFBP3等;其主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞受體、嘌呤代謝、類固醇生物合成、氨酰生物合成等信號通路發(fā)揮治療MDD的作用。結(jié)論：柴胡疏肝散可通過多個靶標(biāo)、多個途徑發(fā)揮輔助治療MDD的作用，可為后續(xù)研究其作用機制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);柴胡疏肝散;重度抑郁癥;靶標(biāo);機制

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the molecular mechanism of Chaihu shugan powder in the adjunctive treatment of major depressive disorder （MDD）. METHODS： Network pharmacology was adopted. The microarray dataset GSE76826 was downloaded from GEO common database， and the limma package was used to screen the differently expressed genes in the samples of MDD patients. The active ingredients and corresponding targets of Chaihu shugan powder were screened out based on TCMSP platform. Through the online software venny 2.1.0， the differently expressed genes of MDD and the targets of Chaihu shugan powder were screened， and the common target genes of Chaihu shugan powder for MDD were obtained. The target genes were introduced into Cytoscape 3.6.1 software to construct the network diagram of “Chaihu shugan powder active ingredients-MDD target gene”. Then， BisoGenet plug-in was used to construct the PPI network， analyze the topological structure and screen the core target gene. KEGG pathway analysis was conducted. RESULTS： There were 139 active components of Chaihu shugan powder for the treatment of MDD， including quercetin， kaempferol， luteolin， stigmasterol， etc. There were 8 core target genes， including NR3C2， DPP4， ALOX5， GSTM1， CCND1， IGFBP3 and so on. They play an important role in the treatment of MDD via signaling pathway such as regulating cell receptor， purine metabolism， steroid biosynthesis， aminoacyl biosynthesis， etc. CONCLUSIONS： Chaihu shugan powder can play a role in the adjunctive treatment of MDD through multiple targets and pathways， which can provide a theoretical basis for the follow-up study of its mechanism.

KEYWORDSNetwork pharmacology; Chaihu shugan powder; Major depressive disorder; Targets; Mechanism

重度抑郁癥（MDD）是一種具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高共病率和高自殺率等特點的情緒性功能障礙疾病[1]，主要臨床表現(xiàn)為情緒抑郁、易疲勞、興趣喪失、精力減退、注意力下降、決策力受損、反應(yīng)遲鈍等。目前，該病的主要治療方式有藥物治療、物理治療及心理治療等[2]。以選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑為代表的一線抗抑郁藥，可以有效緩解抑郁癥患者的憤怒情緒和攻擊性行為，但也存在副作用[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥輔助治療重度抑郁癥，可減輕抗抑郁藥物的副作用，提高患者的依從性及治愈率，如柴胡疏肝散聯(lián)合推拿治療腦卒中后重性抑郁障礙，其治療有效率可達(dá)90%[4];另外，利用柴胡疏肝散顆粒能降低抑郁癥患者的漢密爾頓抑郁量表評分，改善其日常生活能力及抑郁狀態(tài)，提高其血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平[5]。這表明柴胡疏肝散對MDD有一定的輔助治療作用，但其治療MDD的潛在分子機制尚不明確。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過“網(wǎng)絡(luò)靶向多組分”的模式進(jìn)行研究，可預(yù)測中藥化合物的靶向分布和藥理作用，揭示藥物-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，能高效率地從中藥復(fù)方中篩選出多種活性成分，更好地詮釋中藥方劑的組合規(guī)律和網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)[6]。本研究在中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)、多途徑作用的研究思路上，基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，構(gòu)建“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，探討柴胡疏肝散治療MDD的潛在分子機制，以期為該方劑后續(xù)研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 MDD患者基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的獲取

本研究從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中下載序列號為GSE76826的基因芯片數(shù)據(jù)矩陣文件。該數(shù)據(jù)矩陣文件是將年齡≥50歲的32例人體血液轉(zhuǎn)錄組樣本通過Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381探針進(jìn)行試驗處理而得的。該數(shù)據(jù)矩陣文件中包含對照組12例，為健康個體血液樣本的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù);試驗組20例，為MDD患者血液樣本的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。

1.2 MDD患者差異基因的篩選

使用R語言軟件（版本：v.3.5.0）中的limma包對MDD患者的差異基因進(jìn)行篩選。limma包可對RNA測序（RNAseq）數(shù)據(jù)執(zhí)行差異表達(dá)和差異剪接分析[7]。本研究差異基因的篩選條件為P<0.05且|log2 FC|>0.5，其中l(wèi)og2 FC>0.5為上調(diào)，log2 FC<-0.5為下調(diào)[8-9]，然后根據(jù)篩選出的差異基因繪制火山圖。

1.3 柴胡疏肝散活性成分的篩選及靶標(biāo)預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/ tcmsp.php）研究柴胡疏肝散和靶點的相互關(guān)系。以生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件[10-11]篩選出柴胡疏肝散（由柴胡、陳皮、甘草、白芍、川芎、香附、枳殼組成）中每味中藥的活性成分;同時，查詢獲得柴胡疏肝散所有活性成分對應(yīng)的靶標(biāo)，然后通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot. org/）對靶標(biāo)進(jìn)行基因注釋，獲取各個靶標(biāo)對應(yīng)的基因ID。

1.4 構(gòu)建“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

通過在線軟件venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對MDD差異基因和柴胡疏肝散活性成分對應(yīng)的靶標(biāo)基因取交集，獲取MDD與柴胡疏肝散的共同靶標(biāo)基因，即柴胡疏肝散治療MDD的作用靶標(biāo)基因。為了解藥物活性成分與疾病靶標(biāo)基因之間的作用關(guān)系，將共同靶標(biāo)基因與藥物活性成分編排成關(guān)系對文件，再導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析，得到“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?/p>

為了解各個靶標(biāo)基因之間的相互作用關(guān)系，將柴胡疏肝散治療MDD的靶標(biāo)基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件中，使用集網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化和分析功能于一體的生物信息學(xué)工具BisoGenet插件[12]構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過CytoNCA插件對構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，計算Betweenness（BC）值，設(shè)置BC的最小值為600[13-15]，篩選出核心靶標(biāo)基因，構(gòu)建PPI核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因集富集分析

為了篩選出的核心靶標(biāo)基因在MDD中富集的生物學(xué)通路及潛在的作用機制，筆者通過GSEA 4.0.2軟件對核心靶標(biāo)基因進(jìn)行基因集富集分析。通過GSEA算法[16-17]，剔除掉正常樣本后，根據(jù)每個靶標(biāo)基因在MDD患者樣本中表達(dá)量的中位值，分別定義了靶標(biāo)基因的高表達(dá)組和低表達(dá)組兩個表型，然后基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)與靶標(biāo)基因高、低表型的關(guān)聯(lián)度大小進(jìn)行排序，判斷每個京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能基因集內(nèi)的基因是否富集于基因列表的上部或下部，并根據(jù)富集于上下部的情況得到KEGG通路富集結(jié)果[18-19]。GSEA中KEGG通路富集分析的顯著差異的條件設(shè)定為錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05，P<0.05[18，20]。

2 結(jié)果

2.1 MDD差異基因的篩選結(jié)果

基于R語言軟件中的limma包及篩選閾值P<0.05且|log2FC|>0.5，得到808個MDD差異基因，其中上調(diào)基因272個，下調(diào)基因536個，詳見圖1。

2.2 柴胡疏肝散中活性成分及預(yù)測靶標(biāo)的篩選結(jié)果

共篩選出157種活性成分，其中柴胡活性成分17種、陳皮5種、甘草92種、白芍13種、川芎7種、香附18種、枳殼5種;剔除18種重復(fù)成分后，最終獲得139種活性成分。根據(jù)這139種活性成分在TCMSP中共檢索到對應(yīng)靶標(biāo)241個。柴胡疏肝散中部分活性成分及靶標(biāo)基因見表1。

2.3 “柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

通過在線軟件venny 2.1.0將808個MDD差異基因與篩選得到的241個柴胡疏肝散作用的靶標(biāo)基因取交集，共獲得9個共同靶標(biāo)基因NR3C2、DPP4、CYP3A4、ALOX5、GSTM1、GSTM2、ADRB1、CCND1、IGFBP3，其韋恩圖詳見圖2。這9個共同靶標(biāo)基因既是與MDD密切相關(guān)的差異基因，又是柴胡疏肝散活性成分作用的靶標(biāo)，由此推測柴胡疏肝散可通過這些靶標(biāo)治療MDD。將這9個靶標(biāo)基因與柴胡疏肝散活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析，得到“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

將靶標(biāo)基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件后以BisoGenet插件構(gòu)建得到PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖4。結(jié)果表明，9個共同靶標(biāo)基因間均存在直接或間接的相互作用關(guān)系。

對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，根據(jù)BC值>600構(gòu)建PPI核心子網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。該核心網(wǎng)絡(luò)中包含除GSTM2外的8個共同靶標(biāo)基因，即NR3C2、DPP4、CYP3A4、ALOX5、GSTM1、ADRB1、CCND1、IGFBP3，推測這8個共同靶標(biāo)基因不僅在“柴胡疏肝散活性成分-MDD靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，還在PPI網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色，可能是柴胡疏肝散治療MDD的核心靶標(biāo)基因。

2.5 基因集富集分析結(jié)果

根據(jù)“2.4”項下得到的NR3C2、DPP4、CYP3A4、ALOX5、GSTM1、ADRB1、CCND1、IGFBP3核心靶標(biāo)基因在每個MDD患者樣本中表達(dá)量的中位值，分別定義為高表達(dá)組和低表達(dá)組兩個表型。GSEA富集分析結(jié)果顯示，與低表達(dá)組比較，高表達(dá)組有6個核心靶標(biāo)基因的高表達(dá)表型主要富集在細(xì)胞受體、RNA聚合酶、核糖體、嘌呤代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、氨酰生物合成、類固醇生物合成、tRNA生物合成、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)通路，詳見表2。其中，靶標(biāo)基因CYP3A4、ADRB1的GSEA富集結(jié)果未滿足FDR<0.05的篩選條件，故予以剔除。由此可知，柴胡疏肝散活性成分作用的靶標(biāo)基因分布于不同的代謝通路，可通過多化合物、多靶標(biāo)、多途徑輔助治療MDD。

3 討論

3.1 柴胡疏肝散治療MDD的基礎(chǔ)

中醫(yī)將MDD歸屬“郁病”范疇，《內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為外感六淫、七情內(nèi)傷可導(dǎo)致臟腑功能紊亂而發(fā)為郁[21]。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，是中醫(yī)疏肝解郁的代表方劑，自明代以來被廣泛應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡疏肝散可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)細(xì)胞損傷信號通路、抗氧化應(yīng)激等，發(fā)揮抗抑郁癥的作用[22]，但其具體的作用機制尚不明確。因此，研究柴胡疏肝散輔助治療MDD的分子機制具有重要臨床意義。

3.2 柴胡疏肝散抗MDD的活性成分

本研究結(jié)果顯示，柴胡疏肝散的活性成分可能通過多靶點、多途徑參與MDD的輔助治療。其中，槲皮素、山柰酚、木犀草素、豆甾醇、異鼠李素、谷甾醇、川陳皮素等能作用于較多的靶標(biāo)基因，可能是柴胡疏肝散治療MDD的主要活性成分。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素和槲皮素均有抗抑郁作用[23]。槲皮素可通過抗氧化、抗炎、降低興奮性毒性、升高5-羥色胺水平來發(fā)揮抗MDD作用[24]。山柰酚可通過降低氧化應(yīng)激、減少促炎細(xì)胞因子和上調(diào)蛋白激酶B/β-聯(lián)蛋白途徑來發(fā)揮抗抑郁作用[25]。槲皮苷和山柰酚均可通過升高下丘腦POMC mRNA的水平和血漿β-內(nèi)啡肽水平，達(dá)到抗MDD的效果;木犀草素的抗抑郁活性，可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用有關(guān)[26]。

3.3 核心靶標(biāo)基因

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊虶SEA基因集富集分析的結(jié)果表明，NR3C2、DPP4、ALOX5、GSTM1、CCND1、IGFBP3可能是柴胡疏肝散治療MDD的關(guān)鍵靶標(biāo)基因。丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）功能失調(diào)是抑郁癥等疾病的基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)，大腦中核受體亞家族C組成員2（NR3C2）的表達(dá)下降，可導(dǎo)致HPA軸的反饋受限、皮質(zhì)醇水平升高，與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)[27]。二肽基肽酶4（DPP4）能夠通過降解神經(jīng)調(diào)節(jié)肽來調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞，且血清中DDP4是診斷MDD的重要生物學(xué)標(biāo)志物[28]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）是神經(jīng)發(fā)生的重要因子，異常的神經(jīng)發(fā)生可能導(dǎo)致海馬功能障礙和新生齒狀顆粒細(xì)胞的產(chǎn)生減少，從而導(dǎo)致MDD患者認(rèn)知、情感和行為功能的缺陷[29]。同期蛋白D1（CCND1）是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，參與了神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，與損傷后神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育和修復(fù)相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，let-7 miRNA家族不僅可以通過調(diào)控CCND1的活性來干預(yù)抑郁癥，還可以通過靶向白細(xì)胞介素6（IL-6）來參與MDD的炎癥過程[30]。此外，5-脂氧合酶（ALOX5）被證實在炎性疾病的發(fā)生中至關(guān)重要[31]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu-1（GSTM1）也與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)，相關(guān)動物實驗證實，GSTM1在抑郁樣本中表達(dá)增加[32]。

3.4 主要通路

GSEA基因集富集分析結(jié)果顯示，柴胡疏肝散治療MDD的主要信號通路有細(xì)胞受體信號通路、RNA聚合酶、核糖體、嘌呤代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、氨酰生物合成、類固醇生物合成、tRNA生物合成、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。其中，細(xì)胞周期與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)，可通過抵抗神經(jīng)元凋亡和壞死、改變細(xì)胞周期進(jìn)程，從而治療MDD[33]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MDD與氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和氨酰生物合成異常有關(guān)[34]。此外，MDD的發(fā)生與類固醇生物合成密切相關(guān)，如糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)類固醇等。神經(jīng)類固醇通過與大腦中的受體結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，從而影響MDD的病理生理過程[35]。下丘腦功能障礙是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵，神經(jīng)炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)和嘌呤代謝系統(tǒng)失衡是抑郁癥的重要特征，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性抑郁癥中伴隨有氨基酸代謝和嘌呤代謝的紊亂[36]。另外，細(xì)胞因子可能通過影響糖皮質(zhì)激素受體而導(dǎo)致抑郁發(fā)生，目前已有研究證實，可通過抑制炎性細(xì)胞因子及其信號通路、增強糖皮質(zhì)激素受體功能等，達(dá)到治療抑郁癥的目的[37]。

綜上，柴胡疏肝散輔助治療MDD的主要活性成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素等，其作用機制可能與細(xì)胞受體、嘌呤代謝等信號通路有關(guān)，具有多靶標(biāo)、多途徑的特點，可為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-03-24 修回日期：2020-05-08）

（編輯：唐曉蓮）