基于1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)比較熏硫和未熏硫白芷的化學(xué)成分差異及化學(xué)標(biāo)志物篩選

董蕓 田玫瑰 唐榮偉 唐玲 趙程成 張藝 范剛

摘 要 目的：研究熏硫與未熏硫白芷藥材的整體化學(xué)成分差異，并篩選可用于兩者鑒別的化學(xué)標(biāo)志物。方法：分別以硫熏和未硫熏的白芷藥材各16批為檢測(cè)樣品，以氘代甲醇-重水（1 ∶ 0.2，V/V）為提取溶劑，采用氫核磁共振（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩種方法處理的白芷藥材中的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。利用直觀分析、主成分分析（PCA）和t檢驗(yàn)比較二者的化學(xué)成分差異，并確定化學(xué)標(biāo)志物。結(jié)果：從兩種白芷藥材中同時(shí)檢測(cè)并鑒定出了包括香豆素類、氨基酸類、糖類在內(nèi)的19種化學(xué)成分。直觀分析發(fā)現(xiàn)，兩種白芷藥材的化學(xué)成分輪廓相似，但香豆素類和糖類成分的1H-NMR信號(hào)強(qiáng)度有較大的差異;PCA分析結(jié)果顯示，所有樣品按不同處理方法分成兩類;t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，白芷熏硫后氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量均顯著降低（P<0.01或P<0.001），丙氨酸、亮氨酸含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），而其余13種成分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：熏硫和未熏硫白芷藥材中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖、丙氨酸、亮氨酸6種化學(xué)成分存在明顯的差異，可作為化學(xué)標(biāo)志物用于市場(chǎng)上熏硫白芷的鑒別。

關(guān)鍵詞 白芷;熏硫;氫核磁共振代謝組學(xué);化學(xué)標(biāo)志物;鑒別

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the differences in the overall chemical constituents of Angelicae dahuricae with and without sulphur-fumigation， and to select chemical markers that can be used for identification. METHODS： Each 16 batches of A. dahuricae with and without sulphur-fumigation were selected as samples. Deuterated methanol-deuterium oxide （1 ∶ 0.2， V/V） was used as extraction solvent， and 1H-NMR metabolomics was used to detect the primary and secondary metabolites in A. dahuricae. In addition， visual analysis， principal component analysis （PCA） and t-test were used to compare the component differences of A. dahuricae by two kinds of pretreatment methods. RESULTS： A total of 19 chemical constituents such as coumarins， amino acids and sugars were simultaneously detected and identified from two kinds of A. dahuricae. Visual analysis showed that the chemical profiles of the two kinds of A. dahuricae were similar， but their coumarins and carbohydrates were quite different in 1H-NMR signal intensity. PCA analysis showed that all samples could be divided into two categories according to different treatment methods. The results of t-test showed that the contents of oxypeucedanin， imperatorin， glucose and sucrose of A. dahuricae were decreased significantly after sulphur fumigation （P<0.01 or P<0.001）， while the contents of alanine and leucine were significantly increased （P<0.01 or P<0.001）. There was no statistical significance in the contents of other 13 kinds of components （P>0.05）. CONCLUSIONS： There are obvious differences in the 6 chemical compounds of oxypeucedanin， imperatorin， glucose， sucrose， alanine and leucine in A. dahuricae with and without sulphur-fumigation， which can be used as chemical markers for the identification of sulphur-fumigated A. dahuricae in the market.

KEYWORDS? ?Angelicae dahuricae; Sulphur-fumigation; 1H-NMR metabolomics; Chemical markers; Identification

白芷為常用中藥材，來源于傘形科植物白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.]或杭白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan]的干燥根，其味辛，性溫，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿等功效，可用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等[1]。白芷藥材肉質(zhì)根粗壯，富含淀粉，不易干燥，在潮濕環(huán)境下受損處易感染菜豆殼球孢真菌而發(fā)生腐爛[2]。另外，白芷藥材粉性強(qiáng)、香氣濃，在貯藏過程中極易發(fā)生蟲蛀[3]。目前，白芷新鮮藥材在產(chǎn)地大多使用硫磺熏蒸（簡(jiǎn)稱“熏硫”）的方法進(jìn)行加工處理，熏硫有增白、防蟲、防腐、防霉等作用，可使藥材易于保存和銷售。但現(xiàn)代研究表明，熏硫后白芷藥材的香豆素類有效成分發(fā)生了較大的變化[4-6]，影響了藥材的藥效，例如與未熏硫的白芷比較，熏硫白芷的抗炎、鎮(zhèn)痛作用減弱[7]。然而，除香豆素類成分以外，熏硫后白芷藥材中其他成分是否會(huì)發(fā)生變化還未見文獻(xiàn)報(bào)道。此外，白芷熏硫前后藥材的性狀并未發(fā)生明顯的變化，導(dǎo)致市場(chǎng)上白芷藥材是否熏硫難以從外觀上進(jìn)行鑒別。因此，采用新的技術(shù)手段開展白芷熏硫后整體化學(xué)成分變化研究，并尋找新的客觀鑒別方法，對(duì)于該藥材的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用具有重要的意義。

目前，關(guān)于熏硫白芷的化學(xué)成分變化及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，多是采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定特征成分的含量或進(jìn)行指紋圖譜分析[4-6]，但未見從初級(jí)與次級(jí)代謝產(chǎn)物角度開展其質(zhì)量評(píng)價(jià)的報(bào)道。氫核磁共振（1H-NMR）代謝組學(xué)是近年來發(fā)展起來的新興分析技術(shù)，具有初級(jí)與次級(jí)代謝產(chǎn)物同時(shí)表征的優(yōu)點(diǎn)[8-10]。這種整體性評(píng)價(jià)模式與中藥材治療疾病的整體觀、系統(tǒng)論相吻合，為中藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)提供了技術(shù)平臺(tái)。目前，1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于黃連、沙棘、烏梅等中藥材的品種鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中[9-12]。本課題組前期建立了熏硫川白芷的1H-NMR主成分分析（PCA）鑒別預(yù)測(cè)模型[13]，但對(duì)白芷的整體化學(xué)成分沒有進(jìn)行鑒定，也未發(fā)現(xiàn)可區(qū)別熏硫和未熏硫白芷的化學(xué)標(biāo)志物。因此，本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步從整體上鑒定分析白芷藥材的初級(jí)與次級(jí)代謝產(chǎn)物，并結(jié)合PCA分析和t檢驗(yàn)方法，系統(tǒng)研究熏硫和未熏硫白芷的整體化學(xué)成分差異，以期篩選出可用于熏硫白芷鑒別的特征化學(xué)標(biāo)志物，進(jìn)而為白芷的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Varian Mercury Plus 400 MHz型NMR儀（美國Agilent公司）;BP221S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

本研究共收集了32批白芷藥材，包括16批未熏硫藥材及16批熏硫藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院范剛副研究員鑒定均為傘形科植物白芷[A. dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.]的干燥根;異歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110827-201109，純度：98.5%）、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：110739-200814，純度：98.6%）、東莨菪素對(duì)照品（批號(hào)：110768-200504，純度：98.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院;歐前胡素、氧化前胡素、珊瑚菜素、Cnidilin、佛手柑內(nèi)酯和異茴芹內(nèi)酯均為本課題組從白芷藥材中分離得到，經(jīng)HPLC法檢測(cè)其純度均大于98%;重水（D2O，純度：99.9%）、氘代甲醇（CD3OD，純度：99.8%）、3-（三甲基硅基）-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉鹽（TSP）均購自美國Sigma-Aldrich公司;磷酸二氫鉀（成都市科龍化工試劑廠）。藥材來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取干燥的白芷藥材粉末0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，分別加入CD3OD溶液1.0 mL 和 D2O溶液0.2 mL（內(nèi)含0.4 mg/mL TSP 和12.32 mg/mL的磷酸二氫鉀），搖勻，密封，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）提取30 min;取出，放冷，用0.45 ?m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液0.6 mL至標(biāo)準(zhǔn)的5 mm核磁管中，進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。

2.2 1H-NMR分析條件

以CD3OD為頻率內(nèi)鎖，1H-NMR測(cè)定條件為：觀察頻率400.12 MHz，測(cè)定溫度（T）25 ℃，譜寬（sw）6 410.3 Hz，采樣時(shí)間（at）2.556 s，脈沖延遲時(shí)間（dl）2.0 s，采樣次數(shù)（nt）64，脈沖寬度（pw）6 ?s，采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列（Presat）壓制殘留的水峰信號(hào)。

2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

將測(cè)得的1H-NMR自由感應(yīng)衰減（FID）信號(hào)導(dǎo)入MestReNova 6.1.0軟件進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換，并手動(dòng)調(diào)整相位和基線，以TSP峰（0.0 ppm）為基準(zhǔn)校正所有樣品的化學(xué)位移。對(duì)0.50～8.50 ppm范圍內(nèi)的圖譜以0.04 ppm為單位進(jìn)行分段積分（binning），并以總峰面積進(jìn)行歸一化處理，然后以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)，即得到各化學(xué)位移段與之相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰面積值，并扣除甲醇溶劑的信號(hào)（3.26～3.34 ppm）及殘留水峰信號(hào)（4.66～5.02 ppm）。將最終獲得的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 11.5軟件進(jìn)行PCA分析。此外，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組樣品比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 儀器精密度考察 取同一批未熏硫白芷供試品溶液（批號(hào)：BZ-1），分別連續(xù)進(jìn)行1H-NMR測(cè)定5次，按“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)處理方法處理圖譜，得到5組積分值數(shù)據(jù)，運(yùn)用Excel 2007軟件計(jì)算5組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為0.995、0.993、0.997、0.995和0.998，均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.4.2 方法重復(fù)性考察 取同一批未熏硫白芷藥材（批號(hào)：BZ-1）粉末5份，按“2.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，再分別進(jìn)行1H-NMR測(cè)定和數(shù)據(jù)處理，得到5組積分值數(shù)據(jù)，運(yùn)用Excel 2007軟件計(jì)算5組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)，分別為0.994、0.995、0.996、0.998、0.995，均在0.99以上，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.5 白芷整體化學(xué)成分的1H-NMR檢測(cè)及鑒定

取一批未熏硫白芷藥材（批號(hào)：BZ-1）粉末適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。采用“加標(biāo)準(zhǔn)品定性”試驗(yàn)進(jìn)行9種次級(jí)代謝產(chǎn)物（氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、Cnidilin、珊瑚菜素、佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、東莨菪素、補(bǔ)骨脂素）的1H-NMR信號(hào)歸屬，即在供試品溶液中分別加入各對(duì)照品2 mg，超聲2 min使溶解，再進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。通過MestReNova 6.1.0軟件比對(duì)加入對(duì)照品前后的1H-NMR圖譜差異，根據(jù)峰的變化確定信號(hào)歸屬。此外，通過比對(duì)SDBS光譜數(shù)據(jù)庫（http：//sdbs.db.aist.go.jp）及參考相關(guān)文獻(xiàn)[11，14]進(jìn)行氨基酸、糖類等初級(jí)代謝產(chǎn)物的1H-NMR信號(hào)歸屬。結(jié)果，采用1H-NMR分析技術(shù)，從白芷藥材中共鑒定出19種化學(xué)成分（α-葡萄糖和β-葡萄糖計(jì)為1種）。白芷1H-NMR圖譜大致可以分為3個(gè)區(qū)域：高場(chǎng)區(qū)（3.1～0.0 ppm）主要包括有氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、Cnidilin、丁二酸、谷氨酰胺、谷氨酸、醋酸鹽、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸類成分等;中場(chǎng)區(qū)（5.5～3.1 ppm）主要有蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖等;低場(chǎng)區(qū)（9.5～5.5 ppm）主要有異茴芹內(nèi)酯、東莨菪素、補(bǔ)骨脂素等。白芷藥材代表性的1H-NMR圖譜見圖1。

2.6 熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜比較

分別取同一批熏硫（批號(hào)：XLBZ-1）和未熏硫（批號(hào)：BZ-1）白芷藥材粉末各適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項(xiàng)條件下分別進(jìn)行1H-NMR測(cè)定，得到熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜。通過直觀分析，發(fā)現(xiàn)熏硫和未熏硫白芷的整體化學(xué)成分輪廓相似，但二者有些成分的信號(hào)強(qiáng)度有較大的差異，如未熏硫白芷的蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖及一些未鑒定的糖類（3.3～4.1 ppm）的信號(hào)強(qiáng)度明顯高于熏硫白芷，而丙氨酸的信號(hào)強(qiáng)度弱于熏硫白芷。此外，通過放大1H-NMR圖譜的低場(chǎng)區(qū)（6.2～8.5 ppm），發(fā)現(xiàn)白芷熏硫后主要的香豆素類成分（如氧化前胡素、歐前胡素）的信號(hào)強(qiáng)度也有所不同，表明兩種白芷的化學(xué)成分含量有一定的差異。熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜見圖2（注：圖中化學(xué)成分編號(hào)同圖1）。

2.7 基于PCA分析的熏硫和未熏硫白芷差異比較

白芷含有的化學(xué)成分復(fù)雜，其1H-NMR圖譜可以提供大量的化學(xué)成分信息。PCA是最常用的無監(jiān)督模式識(shí)別方法，其能簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，將原始的多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，有利于觀察不同樣本數(shù)據(jù)的分布特征[8]。分別取硫熏和未硫熏的樣品粉末各16批，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項(xiàng)條件下分別進(jìn)行1H-NMR測(cè)定，得到熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜。將1H-NMR測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，研究?jī)煞N處理方法的樣品是否存在差異，結(jié)果見圖3（圖中每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣品）。得分圖中，第一主成分（PC1）得分為97.6%，第二主成分（PC2）得分為1.1%。兩組樣品被明顯地分離，其中熏硫白芷樣品位于PCA得分圖的左邊，而未熏硫白芷樣品位于得分圖的右邊，這表明二者的整體化學(xué)成分存在一定的差異，也說明1H-NMR代謝組學(xué)結(jié)合PCA分析可用于熏硫白芷的鑒別。此外，從圖3也可以看出，熏硫白芷的組內(nèi)差異大于未熏硫白芷，這可能是由于熏硫時(shí)間和硫磺用量不一致所引起的，也說明硫磺熏蒸工藝難以控制，會(huì)影響白芷藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性。

2.8 鑒別熏硫白芷的特征化學(xué)標(biāo)志物篩選

為了確定可用于熏硫和未熏硫白芷鑒別的化學(xué)標(biāo)志物，筆者進(jìn)一步觀察了19種化學(xué)成分在兩組樣品間的實(shí)際水平差異。1H-NMR信號(hào)強(qiáng)度直接與化合物的摩爾濃度成正比，因此化合物的1H-NMR峰面積可以代表其含量高低[9]。本研究以各成分的歸一化峰面積為指標(biāo)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)上述成分在兩組樣品中的差異是否具有顯著性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熏硫后白芷藥材中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量顯著降低（P<0.01或P<0.001），丙氨酸和亮氨酸含量顯著升高（P<0.01或P<0.001），而其余13種成分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。可見，以上6種差異成分為引起兩組樣品間差異的特征化學(xué)標(biāo)志物，可用于熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。6種差異化合物在熏硫和未熏硫白芷樣品中的含量比較見圖4。

3 討論

本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，充分利用其方法學(xué)優(yōu)勢(shì)，從整體層面上同時(shí)分析白芷藥材的化學(xué)成分，鑒定出了包括香豆素類、氨基酸類、糖類等在內(nèi)的19種化學(xué)成分，所建立的1H-NMR圖譜可為白芷藥材的鑒定和質(zhì)量控制提供新的技術(shù)手段。此外，結(jié)合PCA分析和t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白芷熏硫后其初級(jí)代謝產(chǎn)物（糖類、氨基酸類成分）和次級(jí)代謝產(chǎn)物（香豆素類成分）均發(fā)生了變化。其中，氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖、蔗糖、丙氨酸和亮氨酸被確定為白芷藥材的化學(xué)標(biāo)志物，這6種成分可用于熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。雖然1H-NMR法所用儀器昂貴，但本文發(fā)現(xiàn)的主要標(biāo)志物可用更加簡(jiǎn)單、價(jià)廉的方法進(jìn)行檢測(cè)，如可利用HPLC儀、氨基酸分析儀測(cè)定這些成分的含量，再通過與未熏硫白芷對(duì)照藥材進(jìn)行比較，即可判斷市場(chǎng)上白芷藥材是否經(jīng)過熏硫。

歐前胡素和氧化前胡素為白芷藥材的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，歐前胡素具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎和舒張血管等活性[15]，氧化前胡素也具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳及平滑肌解痙等作用[16]，這些藥理活性與白芷藥材的功能主治基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷熏硫后其氧化前胡素和歐前胡素的含量明顯降低，表明藥材的質(zhì)量明顯下降，可能會(huì)影響其臨床療效。除了香豆素類成分，本研究發(fā)現(xiàn)白芷熏硫后的初級(jí)代謝產(chǎn)物（糖類、氨基酸類成分）也發(fā)生了變化，其中糖類成分含量明顯降低，尤其是蔗糖，其含量降低了約60%。此外，與未熏硫白芷相比，熏硫白芷中含有更多的丙氨酸和亮氨酸，這與半夏藥材熏硫后氨基酸類成分含量有所升高的研究結(jié)果類似[17]。白芷熏硫后其糖類成分含量降低可能有利于藥材的貯藏、防蟲和防霉，但熏硫后糖類和氨基酸類成分的含量變化是否會(huì)影響白芷藥材的質(zhì)量還需要進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究了熏硫和未熏硫白芷的整體化學(xué)成分差異，結(jié)果表明，熏硫后白芷藥材的6種化學(xué)成分發(fā)生了明顯的變化，其中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量明顯降低，而丙氨酸和亮氨酸含量明顯升高。因此，這6種成分可作為化學(xué)標(biāo)志物，用于市場(chǎng)上熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。

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（收稿日期：2020-03-03 修回日期：2020-04-19）

（編輯：林 靜）