養(yǎng)殖牙鲆致病性弧菌的鑒定及藥敏分析

高楊

摘?要：2020年丹東東港市某養(yǎng)殖廠養(yǎng)殖1齡牙鲆（Paralichthys olivaceus）突發(fā)病害，表現(xiàn)為腹水病癥狀。取患病的5尾養(yǎng)殖牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水為材料進行細菌分離及純培養(yǎng)，選擇優(yōu)勢菌株通過全自動細菌分析儀及16S rDNA序列分析對該菌株進行鑒定，結(jié)果表明分離純培養(yǎng)的14株菌（DS200401-DS200414）共鑒定出2種，其中1種為該病的致病菌：弧菌屬燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。隨后進行人工感染試驗和藥敏試驗。用12種抗菌藥物對3種菌進行藥敏試驗， 結(jié)果顯示在不同菌株間無明顯的敏感與耐藥性差異。

關(guān)鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）;燦爛弧菌（Vibrio splendidus）;藥敏試驗

丹東東港市8 667 hm2（13萬畝）海水池塘普遍采用多品種立體生態(tài)養(yǎng)殖模式[1]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）作為混養(yǎng)的重要海水低溫經(jīng)濟品種[2]，屬于蝶形目（Pleuronectiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆屬（Paralichthys），由于肉質(zhì)鮮美，深受消費者喜愛。在牙鲆養(yǎng)殖過程中，由于操作管理不當(dāng)和投喂冷凍野雜魚的養(yǎng)殖方式，增加了細菌感染的風(fēng)險，常常導(dǎo)致細菌病爆發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟損失，制約牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。2020年丹東東港市某養(yǎng)殖場大面積暴發(fā)牙鲆腹水病，主要病原是燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。筆者對該養(yǎng)殖場患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，對分離出的致病菌進行了16S rDNA序列分析、藥敏試驗，為養(yǎng)殖牙鲆的病害研究提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

2020年4月東港市某牙鲆養(yǎng)殖戶反映，患病牙鲆表現(xiàn)為體色發(fā)黑，眼球突出，腹水嚴重，直至全部感染。送檢的5尾瀕死牙鲆，體長約25.31～29.86 cm。健康牙鲆取自東港市某養(yǎng)殖場。

1.2?試驗方法

1.2.1?肉眼檢查及剖檢?肉眼觀察患病牙鲆的體表癥狀，解剖病魚，對鰓組織進行鏡檢，并記錄。

1.2.2?細菌分離?在無菌條件下，取患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，用接種環(huán)接種于2216E瓊脂海水培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上[3-4]，劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌的單菌落，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上純化培養(yǎng)。

1.2.3?細菌鑒定

1.2.3.1?分子生物學(xué)鑒定?對分離菌株進行常規(guī)16S rDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3.2?生化鑒定?采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的微生物自動分析系統(tǒng)進行生化特征分析。

1.2.4?人工感染試驗?試驗牙鲆為東港地區(qū)某養(yǎng)殖場健康牙鲆10尾，體長8～10 cm，暫養(yǎng)于兩個200 L水族箱中，溫度控制在15 ℃，充氧并少量投食。試驗組與對照組各10 L水體分別放入5尾牙鲆，采用注射感染[5]方法，每尾魚注射0.05 mL約108 cfu/mL的菌懸液，對照組注射 0.05 mL無菌生理鹽水。觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.5?藥敏試驗?對所分離并經(jīng)鑒定的菌株，采用[6]瓊脂擴散紙片法（K-B）進行對常用抗菌類藥物的敏感性測定。

2?結(jié)果與分析

2.1?發(fā)病情況及主要病變

2020年4月東港市某牙鲆養(yǎng)殖場反映，3月20日左右，十余家養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的1齡牙鲆，經(jīng)室內(nèi)越冬池轉(zhuǎn)移到室外土池塘?xí)r，均出現(xiàn)魚體發(fā)黑，眼球突出，腹部膨大，停止攝食最終死亡。共計養(yǎng)殖牙鲆100萬尾，病死率高達67.6%。送檢的5尾患病牙鲆，體長約25.31～29.86 cm，鰓絲完好，1尾體表有潰爛，解剖后5尾魚存在白色混濁腹水，肝臟脾臟腫大，腸壁出現(xiàn)充血水腫，腸道內(nèi)無食物且充滿淡黃色黏液，1尾腸道內(nèi)有白色線團狀物。

2.2?病原形態(tài)特征

取病魚的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，從鰓上分離出一株細菌，只在2216E平板上生長，形成圓形光滑，邊緣整齊突出，白色較小的菌落。在脾臟、腸道、腹水中分離出的細菌，同時生長于2216E平板和TCBS平板，形成圓形光滑，黃色突起的菌落，大小有差異。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌。

2.3?病原菌的生理、生化鑒定

由全自動細菌分析儀對病原菌的生理生化檢測結(jié)果可知，該病原菌初步鑒定為弧菌屬細菌。

將分離菌所擴增的16S rDNA基因序列進行Blast比對結(jié)果顯示，從鰓上分離出的菌株 DS200401為腸桿菌。從脾臟，腸道，腹水中分離出的菌株DS200404、DS2004008、DS2004013基因與燦爛弧菌（Vibrio splendidus）相應(yīng)基因相似率達98%。分離菌所擴增的16S rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號為MT445177-MT445179，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，菌株與燦爛弧菌聚為一支。

2.4?人工感染試驗

試驗組的5尾牙鲆魚感染后的4～5 d死亡2尾，發(fā)病3尾，解剖觀察肝臟脾臟出現(xiàn)腫大，腸道有黃色黏液，3尾魚有腹水。對發(fā)病牙鲆進行細菌分離鑒定，結(jié)果與原感染菌一致 。

2.5?藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，三株細菌DS200404、DS2004008、DS2004013對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等抗生素敏感，對青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。不同菌株間耐藥差異不明顯。

3?討論

作者首次從丹東地區(qū)患病的牙鲆體內(nèi)分離出三株菌，并命名為DS200404、DS2004008、DS2004013。經(jīng)鑒定均為燦爛弧菌。該菌是刺參腐皮病[7-9]的主要病原，感染牙鲆的文章還未見報道。通過人工感染試驗可知，該菌是致病菌，也是牙鲆細菌病的主要病原之一。

牙鲆弧菌病發(fā)于春夏季節(jié)[4，5，10]，尤其早春季節(jié)危害最為嚴重 。養(yǎng)殖牙鲆經(jīng)歷越冬期后，免疫力較低，放入土池后，由于環(huán)境改變，易發(fā)生細菌感染;池塘清池時若殘留漂白粉等藥物，易造成牙鲆藥物中毒;傳統(tǒng)的投喂冷凍野雜魚的養(yǎng)殖方式[11]，增大了牙鲆細菌感染的風(fēng)險。

由藥敏試驗結(jié)果可知，燦爛弧菌對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等6種抗生素敏感。在防治水產(chǎn)生物細菌性疾病時不要濫用[12]抗生素類藥物，避免細菌耐藥性的產(chǎn)生，增加病害控制的難度。確定藥物的最低有效濃度及菌株的耐藥性是下一步工作的方向。

通過以上檢測結(jié)果可知，此次牙鲆魚養(yǎng)殖池暴發(fā)的腹水病主要病原是燦爛弧菌，建議養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中保證良好水質(zhì)，選擇優(yōu)質(zhì)餌料，提高魚體抗病力，并用配合飼料替代冷凍野雜魚降低感染風(fēng)險。

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（收稿日期：2020-06-02）