實(shí)驗(yàn)魚生物餌料的質(zhì)量控制

李建軍蔡 磊余露軍黃 韌

(廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所,廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510663)

實(shí)驗(yàn)動物飼料質(zhì)量是與實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量密切相關(guān)的重要條件,也是保證動物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)魚個體小,口徑小,其微粒飼料應(yīng)滿足下列基本條件：1)符合實(shí)驗(yàn)魚攝食習(xí)性、生理機(jī)能及不同生長時期的營養(yǎng)需求;2)水中穩(wěn)定、懸浮、不結(jié)團(tuán),粒徑合適;3)誘食,易被發(fā)現(xiàn)和捕食;4)適口,易消化吸收[1]。近年來國內(nèi)外微粒飼料的配方和制備工藝技術(shù)雖取得一定進(jìn)步,但仍無法達(dá)到生物餌料飼喂的生長率和存活率[2]。生物餌料指經(jīng)過人工篩選的、可進(jìn)行人工培養(yǎng)且適合養(yǎng)殖對象采食的生物,其具有適口、營養(yǎng)豐富、增殖快、增強(qiáng)抗病能力、對水質(zhì)污染小等特點(diǎn)[3],被公認(rèn)為是當(dāng)今及今后較長時間內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚的主要飼料。

1 生物學(xué)特性

目前實(shí)驗(yàn)魚的主要生物餌料有：大草履蟲(Paramecium caudatum)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)和鹵蟲(Artemia salina)等。

草履蟲是浮游動物的重要組成部分,具有分布廣、個體大、易培養(yǎng)、繁殖快等特點(diǎn)[4],是斑馬魚等許多水生經(jīng)濟(jì)動物幼體的開口餌料。目前世界上已報導(dǎo)草履蟲22種,我國草履蟲常見種為大草履蟲(又稱尾草履蟲),隸屬于纖毛綱(Ciliata)、膜口目(Hvmenostomatida)、咽膜亞目(Peniculina)、草履蟲科(Parameciidae)、草履蟲屬(Paramecium)。大草履蟲長180～280μm,繁殖適溫10℃～30℃,生長最適溫度25℃;適宜pH值5.0～10.0,中性略偏酸環(huán)境生長較好,常在有機(jī)質(zhì)較多的死水或緩流中生活[5-6]。

輪蟲屬輪蟲動物門(Rotifera)、輪蟲綱(Rotifera)、真輪亞綱(Eurotatoria),其大小適宜、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快、易大量培養(yǎng),是一種重要的水生動物餌料[7]。其中使用最廣泛的皺褶臂尾輪蟲,大小在150～360μm之間,分為 L型和S型[8]。

鹵蟲屬節(jié)肢動物門(Phylum Arthropoda)、有鰓亞門(Subphylum Branchiata)、甲殼綱(Class Crustacea)、鰓足亞綱(Subclass Branchioplda)、無甲目(Order Anostraca)、鹽水豐年蟲科(Family Branchinectidae)、鹵蟲屬(Artemia)[9]。無節(jié)幼體長500～700μm、寬180～250μm,不同品系大小略有差異;世界各大陸的鹽湖、鹽田等高鹽水域中均有分布,傳播的主要媒介為風(fēng)和水鳥;幼蟲適鹽范圍為20～100,成蟲為 10～25;耐溫范圍 6℃ ～35℃,生長最適溫度25℃～30℃;可耐1 mg/L低氧,也能生活于1～1.5倍飽和氧環(huán)境;孵化用水pH值8～9為宜,低于8孵化率降低;主要濾食50μm以下的顆粒,5～16μm的顆粒攝食率較高,天然環(huán)境中以細(xì)菌、微藻和有機(jī)碎屑等為食。

2 營養(yǎng)成分

2.1 主要營養(yǎng)成分含量

草履蟲營吞噬營養(yǎng),細(xì)胞質(zhì)中含有蛋白質(zhì)、多糖和脂類等物質(zhì),含水率75%～85%。

褶皺臂尾輪蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量占干重28%～63%,脂類占9%～28%,面包酵母培養(yǎng)的輪蟲,其總脂類含量較低,延長藻類或經(jīng)脂類強(qiáng)化的酵母的投喂時間可提高輪蟲脂類含量[10]。

脫殼后鹵蟲卵、初孵無節(jié)幼體和養(yǎng)殖成蟲的總蛋白質(zhì)含量分別為43%～57%、54.6%～59.9%和55.6%～58.2%[11];鹵蟲卵總脂肪含量為17.98%,去殼卵粗脂肪含量16.64%,初孵無節(jié)幼體脂肪占干重的20.84～23.53%。鹵蟲卵及其初孵無節(jié)幼體含較多的棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞麻酸、亞油酸。成蟲除含有大量的不飽和脂肪酸外,還含較多維生素、胡蘿卜素、抗壞血酸。鹵蟲休眠卵內(nèi)甘油和海藻糖分別占干卵重的5%和15%～17%[12]。

2.2 營養(yǎng)成分影響因素

草履蟲培養(yǎng)液的制備方法有多種,主要包括：稻草培養(yǎng)法、玉米培養(yǎng)液法、酵母片培養(yǎng)液法、沼液培養(yǎng)液法、麥粒培養(yǎng)液法及其他培養(yǎng)液法,另外,西瓜皮、香蕉皮、香瓜皮、桃子皮等材料以及池沼的禾本科植物或當(dāng)年的禾本科農(nóng)作物均可培養(yǎng)出草履蟲[13]。玉米穗、玉米粒培養(yǎng)液因營養(yǎng)豐富,能產(chǎn)生大量細(xì)菌,利于草履蟲繁殖,培養(yǎng)效果較好。而荷葉、槐葉營養(yǎng)成分低,新鮮荷葉、槐葉在晾干過程中可能產(chǎn)生不利于細(xì)菌生長的物質(zhì),培育效果欠佳。

天然環(huán)境中的輪蟲和鹵蟲營養(yǎng)價值全面。酵母培養(yǎng)的輪蟲大多缺乏N-3系列高度不飽和脂肪酸,特別是EPA和DHA,而海洋微藻中EPA、DHA含量較高,因此可選用N-3系列不飽和脂肪酸含量豐富的藻種如三角褐指藻、新月菱形藻、纖細(xì)角毛藻、球等鞭金藻、小球藻、微綠球藻等對酵母輪蟲進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化[14]。

鹵蟲的營養(yǎng)成分與其品系、發(fā)育階段、生存環(huán)境(特別是餌料條件)等因素有關(guān)[11]。鹵蟲生長發(fā)育時,其體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量逐漸增加,且隨所攝取的餌料等因素的變化而變化。不同品系鹵蟲蛋白質(zhì)含量不同。脂肪酸的組成及含量是影響鹵蟲營養(yǎng)價值的主要指標(biāo)[15]。不同品系鹵蟲脂肪酸含量不同,18 ∶3ω3、18 ∶4ω4、20 ∶5ω5 含量尤其差別大[16]。鹵蟲卵孵化是體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗的過程,其脂肪酸含量逐漸減少,特別是卵磷脂。即使是同一品系的鹵蟲卵,孵化條件不同,無節(jié)幼體含有的能量也不同。低鹽高溫孵化,鹵蟲初孵無節(jié)幼體含有的能量較多[12]。

3 有毒有害物質(zhì)

Mansouri-Aliabadi等[17]研究表明,重金屬(鋅、鎳和鉛)可通過食物傳遞到草履蟲;陳偉琪等[18]研究也顯示,藻類、輪蟲等海洋生物都能直接從海水中吸收銅,銅可沿著海水→扁藻→輪蟲→仔蝦進(jìn)行傳遞;大連灣海域浮游生物體內(nèi)Pb和Cd含量超過生物污染評價標(biāo)準(zhǔn)[19]。欽州灣東部海域浮游生物Cd、Hg含量達(dá) 1.51×10-1mg/kg干重、9.48×10-3mg/kg干重,遠(yuǎn)高于水體含量,呈現(xiàn)出重金屬從水體到浮游生物的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律,浮游生物對重金屬的富集系數(shù)最高達(dá)40 000,表明浮游生物對重金屬有很強(qiáng)的富集能力[20]。因此,野生環(huán)境下的生物餌料(如草履蟲、輪蟲、鹵蟲)可富集水環(huán)境中的重金屬等多種有毒有害物質(zhì),在使用生物餌料時應(yīng)對其有毒有害物質(zhì)含量進(jìn)行檢測評價。

由于各種來源的生物餌料質(zhì)量良莠不齊,目前已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對生物餌料有毒有害物質(zhì)進(jìn)行規(guī)定,如DB13/T 787-2006《褶皺臂尾輪蟲土池養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范》[21]和 DB13/T 789-2006《鹵蟲養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范》[22]要求作為生物餌料的輪蟲和鹵蟲有毒有害物質(zhì)含量應(yīng)嚴(yán)格低于NY 5073《無公害食品 水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》[23]的規(guī)定。實(shí)踐表明,實(shí)驗(yàn)室培育的草履蟲、輪蟲和質(zhì)量較好的鹵蟲,其有毒有害物質(zhì)含量可符合NY 5073《無公害食品水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》[23]的要求(表1),風(fēng)險可控。

4 攜帶病原

國內(nèi)外已有較多關(guān)于生物餌料可能攜帶致病微生物的報道,如鹵蟲卵和輪蟲休眠卵可通過PCR方法檢測到WSSV陽性[24-25];宋曉玲等[26]研究也顯示橈足類、鹵蟲等可檢出WSSV;何建國等[27]通過人工感染和PCR方法證明橈足類是WSSV的宿主,而且進(jìn)一步證明橈足類是WSSV等病毒傳播的媒介生物之一。同時,生物餌料也是弧菌的重要攜帶者,Thompson等[28]、Gomezgil等[29]從海水輪蟲中分離到多種弧菌;吳崗等[30]從市售鹵蟲分離到3種優(yōu)勢弧菌;Bergh等[31]、Alvise等[32]研究表明鹵蟲和輪蟲可傳播水產(chǎn)上危害極大的鰻弧菌。鑒于生物餌料存在攜帶病原微生物風(fēng)險,許多學(xué)者提出了加強(qiáng)鹵蟲卵等生物檢驗(yàn)檢疫的方法和策略,但尚無專門的病原檢疫程序[33]。

國內(nèi)外已有學(xué)者成功培育無菌輪蟲和無菌鹵蟲[34-35],但生產(chǎn)上更多的是采用臭氧、消毒劑等方法消毒或益生菌定植培養(yǎng)等方法對輪蟲、鹵蟲等生物餌料的致病微生物進(jìn)行控制,并取得了非常理想的效果[36-37]。從上述研究結(jié)果可知,使用生物餌料時應(yīng)對其病原微生物進(jìn)行檢測和評價,經(jīng)嚴(yán)格消毒控制或凈化培育的草履蟲、輪蟲、鹵蟲等生物餌料攜帶病原風(fēng)險可控。

5 推薦生物餌料質(zhì)控要求

5.1 草履蟲培育

5.1.1 草履蟲引種時的純化

將含有草履蟲的液體吸入表面皿(或凹玻片)中,在顯微鏡或解剖鏡下檢查,用直徑約0.2 mm的微吸管將表面皿(或凹玻片)中的草履蟲逐個吸出(必要時用超純水或去離子水反復(fù)稀釋、沖洗)培養(yǎng)。

表1 實(shí)驗(yàn)室培育褶皺臂尾輪蟲和鹵蟲有毒有害物質(zhì)檢測結(jié)果(mg/kg)Table 1 Detection results of toxic and harmful substances in Brachionus plicatilis and Artemia salina cultured in laboratory

5.1.2 草履蟲的培養(yǎng)

將純培養(yǎng)的草履蟲倒入至500 mL或1000 mL燒杯中,加適量除氯的自來水,每天滴加1～2滴新鮮配制濃度為0.9～3.0 g/L的酵母原液,在水溫22℃～28℃、pH值6.5～7.5的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程盡量保持環(huán)境因子恒定。

5.1.3 草履蟲的收集投喂

當(dāng)培養(yǎng)液中草履蟲密度較大時,收集培養(yǎng)液表面的草履蟲,用仔魚養(yǎng)殖水沖洗(必要時用300～500目篩絹過濾),稀釋至每毫升100～150個的密度投喂。

5.2 褶皺臂尾輪蟲培育

5.2.1 褶皺臂尾輪蟲的純化

將含有褶皺臂尾輪蟲的液體吸入表面皿(或凹玻片)中,在顯微鏡或解剖鏡下檢查,用直徑約0.5 mm的微吸管將表面皿(或凹玻片)中的褶皺臂尾輪蟲逐個吸出(必要時用滅菌海水反復(fù)稀釋、沖洗)培養(yǎng)。

5.2.2 褶皺臂尾輪蟲的培養(yǎng)

培養(yǎng)用水需經(jīng)砂濾、300目的篩絹網(wǎng)過濾或其他方式處理以除去小型甲殼動物等敵害生物。鹽度15～25,pH 值 7.5～8.5,溫度 25℃ ～30℃,溶氧2.0 mg/L以上,非離子氨1.0 mg/L以下,光照強(qiáng)度500 lx左右,可連續(xù)照明,也可間隔照明(如光暗周期為18∶6),或自然光照。

接種褶皺臂尾輪蟲的密度每毫升不宜小于0.1個。宜采用海水小球藻培養(yǎng),藻類密度約保持為每毫升2.0×106個細(xì)胞。如以酵母培養(yǎng),投喂魚苗前應(yīng)采用海水小球藻進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化24 h以上。連續(xù)充氣,充氣量不宜過大。經(jīng)常檢查輪蟲的生長情況,輪蟲死殼多,身體上附著污物,沉底、不活潑、不帶卵或帶冬卵為不良情況,應(yīng)改進(jìn)培養(yǎng)方法。

5.2.3 褶皺臂尾輪蟲的投喂

投喂前經(jīng)60目篩絹網(wǎng)過濾除去藻渣等雜質(zhì),300目篩絹網(wǎng)收集輪蟲。

5.3 鹵蟲孵化與投喂

5.3.1 鹵蟲卵的質(zhì)量要求

可購買商品卵。鹵蟲卵孵化率≥80%,含水率≤8.0%,雜質(zhì)≤1.0%。檢驗(yàn)按SN/T 0476的規(guī)定執(zhí)行。運(yùn)輸過程中應(yīng)防止包裝破損、日曬、雨淋。鹵蟲卵應(yīng)在低溫(-20℃～4℃)、干燥、避光、密封環(huán)境下貯存。嚴(yán)禁與有毒、有害物品混合存放。開罐后鹵蟲卵應(yīng)盡快使用。

5.3.2 鹵蟲卵的孵化

孵化前用2%～3%的福爾馬林浸泡10～15 min,或次氯酸鈉(有效氯達(dá)20 mg/L)溶液浸泡30 min,然后用清水沖洗,也可采取其他消毒方法。孵化密度不宜超過每升3.0 g干重。水溫25℃～30℃、鹽度10～30、pH7.5～8.2,光照 1000 ～3000 lx,溶解氧大于5.0 mg/L。連續(xù)充氣,充氣量以能把容器底部的蟲卵充分吹起并使卵均勻分布為宜。

5.3.3 鹵蟲的投喂

投喂前去除空殼和未孵化的鹵蟲卵,用150目篩絹網(wǎng)袋收集、沖洗鹵蟲無節(jié)幼體。幼體孵出后24 h內(nèi)投喂。也可投喂經(jīng)清洗的脫殼鹵蟲卵。

6 小結(jié)

綜上所述,大草履蟲、褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲等浮游生物大小適宜,營養(yǎng)豐富,增殖迅速,便于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),對水質(zhì)污染小,按質(zhì)量控制要求培養(yǎng)攜帶病原和有毒有害物質(zhì)風(fēng)險可控,是實(shí)驗(yàn)魚的優(yōu)良餌料。