生產(chǎn)工藝對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響研究

郁建生，郁建平，胡美忠，梁 浩，錢璽丞，吳 浪

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,貴州銅仁 554300； 2.民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,貴州銅仁 554300；3.貴州大學(xué)生化營養(yǎng)研究所,貴陽 550025)

中藥博落回又名號筒桿，勃勒回，山梧桐等，系罌粟科植物博落回[Macleayacordata(willd) R.B]的帶根全草入藥，廣泛分布于長江流域以南各省，特別是云、貴、川較多見，遍生于荒山野坡，隨處可見，并可人工種植。民間用其治療癰腫疔毒，惡瘡潰瘍，燙傷頑癬、風(fēng)濕痹癥、跌打損傷、疥瘡等體表疾患，因其大毒，不作內(nèi)用[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，博落回的有效藥用成分為生物堿，也提取分離出血根堿(sanguinarine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)、博落回堿(bocconoline)、原阿片堿(protopine)、別隱品堿(allocryptopine)、小檗堿(berberine)等多種，均屬異喹啉類生物堿[1-2,6]。博落回生物堿是一種具有抗菌消炎、清熱解毒、增強(qiáng)免疫功能、抑制多種病原菌、抗病毒、抗腫瘤等多種功效作用，廣泛用于人、畜多種感染性疾病治療[3-5]。

提取博落回生物堿(主要有血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿)后將其制成口服液用以治療仔豬下痢、家禽腸炎等畜禽消化道疾病取得較好效果[4，6]，試驗(yàn)表明，采用液體口服給藥，藥物直接進(jìn)入胃腸道對腸道疾病效果好，口服液給藥一是能極大的方便投藥，節(jié)約大量人力物力，特別適合規(guī)?；B(yǎng)殖防控用藥，二是生產(chǎn)工藝簡化，降低生產(chǎn)成本，是博落回獸藥產(chǎn)品中值得研究開發(fā)的一種新制劑。由于血根堿、白屈菜紅堿分子中含有不穩(wěn)定的環(huán)氧基、芳香季胺等基團(tuán)，影響其生物堿的穩(wěn)定性[7]，而博落回生物堿質(zhì)量穩(wěn)定性直接影響著口服液的質(zhì)量穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是保證口服液質(zhì)量及有效期時間的重要技術(shù)指標(biāo)。為了更好的考察博落回生物堿類化合物在口服液中的穩(wěn)定性，本研究進(jìn)行了口服液質(zhì)量穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用博落回果均采自貴州省松桃縣大興鎮(zhèn)大興村同一地點(diǎn)，由銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸藥研究所進(jìn)行鑒定及采用統(tǒng)一的干燥方法加工制樣。

博落回口服液由銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸藥研究所、民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心研制，銅仁民族獸藥廠生產(chǎn)。由博落回果莢經(jīng)提取有效成分生物堿后精制而成(成品每毫升含有效成分總生物堿不低于5 mg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 標(biāo)準(zhǔn)品血根堿(sigma,98%),白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿、小檗堿均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品、純度大于98%，HPLC用試劑乙腈為色譜純，其它試劑：H2SO4、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、NaHSO3、NaSO3、EDTA、吐溫-80等均為分析純，乙醇為95%食用酒精。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent1290高效液相色譜儀(安捷能科技有限公司)，TU—1901紫外可見分光光度計(北京普析)，50/100 mL玻璃反應(yīng)釜(上海普渡生化科技有限公司)，RE—52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)，PHSJ—3F精密酸度計(上海雷磁)，電子天平(美國奧豪斯)，LC-3000藥物穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)箱(上海醫(yī)療器械廠)，微高壓藥汁提取機(jī)(上海泰壓格)，ALG5/100自動灌裝封口機(jī)(上海國彩)，液體自動混合機(jī)(北京長安儀器廠)，鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)，植株樣本粉碎機(jī)(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 博落回生物堿含量測定方法 博落回總堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量采用高效液相色譜法測定，色譜條件(色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.2%三乙胺溶液與乙腈，測定波長271 nm)、對照品溶液制備、供試品溶液制備、測定方法等均按農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心主編的“獸醫(yī)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編”(2006-2011年)方法進(jìn)行測定[2,8]。

博落回總生物堿得率=博落回總生物堿質(zhì)量/博落回果莢質(zhì)量×100%，博落回生物堿單體得率=博落回生物堿單體質(zhì)量/博落回總生物堿質(zhì)量×100%[9]。

1.4.2 博落回口服液生產(chǎn)工藝[10,11]由博落回果莢經(jīng)提取有效成分生物堿后精制而成。采用液體生產(chǎn)法，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選生產(chǎn)工藝如下： 取博落回果莢制粗粉過40目篩后精密稱取1 kg放入反應(yīng)釜，用85%酸性乙醇60 ℃保溫攪拌浸提二次(每次1 h，乙醇用量為藥材量8-10倍)，冷卻，合并醇浸提液過濾，濾液減壓回收乙醇，得濃縮液(含醇量30%)，冷卻過濾，濾液用10%H2SO4調(diào)PH4-5后加熱至90～100 ℃保持10～20 min后減壓回收乙醇至盡，冷卻過濾，加入口服液總量1.5%的吐溫-80及口服液總量5%的葡萄糖，加口服用水至足量，調(diào)PH，精濾，灌裝、熔封、攝氏100度流通蒸汽滅菌30 min即得(使成品每毫升含有效成分總生物堿不低于5 mg，含葡萄糖不低于5 mg)。

1.4.3 不同提取工藝對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響 取干燥后博落回果莢粗粉粹過40目篩備用，精密稱取處理好的博落回果莢干燥粗粉各五份，每份1 kg，分別采取酸水浸提法、乙醇浸提法、酸性乙醇浸提法提取博落回生物堿，各得提取液500 mL,按1.4.1 法測定總生物堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量。

1.4.4 不同乙醇濃度對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響[2,11]精密稱取處理好的博落回果莢干燥粗粉七份，每份100 g，分別置1000 mL三角瓶中，對應(yīng)加入濃度分別為30%，40%，60%、70%，70%，80%，90%的乙醇100 mL后于電動震蕩機(jī)上，頻率120次/min，間隔振搖2 h后濾出，定容，按1.4.1 法測定總生物堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量。

1.4.5 滅菌對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響[11]取按1.4.2法制成的口服液三批，每批500 mL，按1.4.1法測定滅菌前后博落回總生物堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量及博落回口服液在不同的溫度、時間下存放后生物堿含量變化。

1.4.6 不同 pH值對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響[11]取處理好博落回果莢干燥粗粉，按1.4.2方法制成口服液，分取口服液八份，每份50 mL，分別用4%NaOH液及10%H2SO4液調(diào)不同的pH值后制成口服液，100℃滅菌30 min，按1.4.1方法測定總生物堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量。

1.4.7 不同附加劑對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響[11]取處理好博落回果莢干燥粗粉，按1.4.2方法制成口服液，分取口服液八份，每份50 mL，分別加入不同的附加劑(加入量EDTA為0.01%，其余均為0.2%)后制成口服液，100℃滅菌30 min，按1.4.1方法測定總生物堿及血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿的測定 見下圖1、圖2

2.2 不同提取工藝對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響 見下圖3。

(從左到右 原阿片堿，別隱品堿，血根堿，小檗堿，白屈菜紅堿)圖1 博落回提取物對照品HPLC圖Fig 1 HPLC of Macleaya cordata extract reference substance

(從左到右 原阿片堿，別隱品堿，血根堿， 白屈菜紅堿)圖2 博落回口服液樣品HPLC圖Fig 2 HPLC of sample of oral liquid made Macleaya cordata

圖3 不同提取工藝對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響Fig 3 Effect of different extraction process on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

由圖3可知：不同提取工藝對生物堿濃度影響較大，生物堿濃度以酸性乙醇浸提法最高，總堿提取率可達(dá)到11.6%，血根堿提取率4.8%，白屈菜紅堿提取率1.73%，原阿片堿提取率達(dá)3.85%，別隱品堿提取率1.92%。生物堿濃度從小到大順序?yàn)榉兴崛》ī偹崴岱ī傄掖冀岱ī?酸性乙醇浸提法。

2.3 乙醇濃度對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響，結(jié)果見下圖4。

圖4 乙醇濃度對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響Fig 4 Effect of ethanol concentration on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

由圖4可知：90%的乙醇對博落回總生物堿提取率均在9.65%，血根堿提取率3.40%，白屈菜紅堿提取率1.44%，原阿片堿提取率3.20%，別隱品堿提取率1.60%。乙醇濃度越高, 博落回生物堿提取率越高, 效果越好,質(zhì)量越穩(wěn)定。

2.4 滅菌對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響 博落回口服液100℃滅菌前后生物堿質(zhì)量變化，見下表1。

從表1可見，滅菌后三批口服液樣品總生物堿含量平均下降0.15 mg/100 mL，占總量的2.8%；血根堿含量平均下降0.06 mg/100 mL，占總量的3.1%；白屈菜紅堿含量平均下降0.02 mg/100 mL，占總量的2.8%；原阿片堿含量平均下降0.05 mg/100 mL，占總量的2.8%；別隱品堿含量平均下降0.02 mg/100 mL，占總量的2.2%，變化小是非常穩(wěn)定的。

表1 博落回口服液滅菌前后質(zhì)量穩(wěn)定性變化Tab 1 The changes of quality stability of oral liquid made Macleaya cordata before and after sterilization

2.5 不同 pH值對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響 不同 pH值對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響結(jié)果見下圖5。

圖5 不同 pH值對博落回口服液穩(wěn)定性影響Fig 5 Effect of different pH value on the stability of the oral liquid made Macleaya cordata

由圖5可知：口服液的pH值在5時博落回總生物堿濃度在6.32%，血根堿濃度2.23%，白屈菜紅堿濃度0.94%，原阿片堿濃度2.09%，別隱品堿濃度1.05%?？诜簆H值在4時血根堿濃度2.86%，以pH值在4～6時生物堿含量最高，最穩(wěn)定。

圖6 不同添加劑對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性影響Fig 6 Effect of different additives on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

2.6 不同附加劑[8]對博落回口服液質(zhì)量穩(wěn)定性的影響 由圖6可知：硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉對總生物堿的質(zhì)量穩(wěn)定性影響較大，可使總生物堿質(zhì)量降低0.37～0.67 mg/100 mL，血根堿濃度降低0.02～0.22 mg/100 mL，白屈菜紅堿濃度降低0.06～0.1 mg/100 mL，原阿片堿濃度降低0.13～0.23 mg/100 mL，別隱品堿濃度降低0.06～0.11 mg/100 mL，在生產(chǎn)中應(yīng)避免使用；而EDTA、吐溫-80、Vc、亞硫酸氫鈉等附加劑對總生物堿質(zhì)量穩(wěn)定性影響甚小，適合選用。

3 討論與結(jié)論

目前，以天然植物博落回所含生物堿類為原料研發(fā)生產(chǎn)的獸藥制劑有博落回注射液、博落回散等，但博落回口服液尚無產(chǎn)品上市，博落回制劑是一種純天然綠色獸藥產(chǎn)品，用以治療仔豬下痢、家禽腸炎等畜禽消化道疾病及促進(jìn)豬、雞生長取得較好效果[4,6]，更是當(dāng)前“替抗”產(chǎn)品的優(yōu)秀品種。試驗(yàn)表明，采用口服給藥，藥物直接進(jìn)入胃腸道對腸道疾病效果好，口服液給藥能極大的方便投藥，節(jié)約大量人力物力，特別適合規(guī)?；B(yǎng)殖防控用藥，是一種值得研究開發(fā)的博落回獸藥新制劑。本法采用液體生產(chǎn)法生產(chǎn)口服液，可減少博落回生物堿提取純化干燥工序，節(jié)約人力物力時間，降低生產(chǎn)成本。

博落回在獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用關(guān)鍵難題之一是生物堿的提取分離。研究表明，4種提取生產(chǎn)工藝對生物堿提取得率影響較大，最高為11.6%，最低為8.15%，提取率從低到高依次為沸水提取法﹤酸水浸提法﹤乙醇浸提法﹤ 酸性乙醇浸提法。而酸性乙醇為博落回生物堿首選提取液，乙醇濃度增高，提取率逐漸增大，80～90%的乙醇提取率均在90%以上。

博落回口服液是以植物博落回為原料經(jīng)提取生物堿后制成，主要含血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等生物堿。研究表明，三批口服液樣品在滅菌后生物堿含量平均下降0.15 mg/100 mL，占總量的2.8%；所以生物堿含量是比較穩(wěn)定的，變化小。

pH值是口服液質(zhì)量穩(wěn)定的一項(xiàng)重要指標(biāo)，研究表明，pH值變化對博落回口服液生產(chǎn)過程中生物堿含量穩(wěn)定性影響較大，口服液的pH值在4-6時生物堿含量高較穩(wěn)定。

在口服液的生產(chǎn)中，常常加入抗氧劑及金屬絡(luò)合劑等附加劑以防止和延緩藥物的氧化分解，加入助溶劑以增加藥液的澄明度。而這些附加劑的加入既要保護(hù)藥物的有效成分不受氧化分解，又要不影響藥物制劑的穩(wěn)定性、澄明度和療效。研究表明，硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉對生物堿的質(zhì)量穩(wěn)定性影響較大，可使生物堿質(zhì)量降低0.67～0.37 mg/100 mL，在生產(chǎn)中應(yīng)避免使用；而EDTA、吐溫-80、Vc、亞硫酸氫鈉等附加劑對生物堿質(zhì)量穩(wěn)定性影響較小，適合選用。加入抗氧劑后可使口服液的顏色淺淡而改善藥液的澄明度。