益母黃丹口服液的制備工藝研究

孔 潔，孫弟芬，潘舒蕾，文 敏，葉臍濂，張 鵬，舒 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 611130)

益母黃丹口服液由益母草、黃精、丹參三味中藥制成。益母草為君藥，其中的益母草堿可以促進(jìn)子宮和卵巢的發(fā)育，興奮下丘腦垂體性腺軸，促進(jìn)性腺激素的分泌，進(jìn)而影響蛋雞的生產(chǎn)性能，其主要化學(xué)成分有生物堿類、二萜類、黃酮等[1-3]。孫曉蛟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加益母草后產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)均顯著提高。黃精為臣藥，能調(diào)節(jié)氣血，增強(qiáng)鵪鶉的抵抗力，增加了飼料的利用率。黃精多糖是黃精重要的活性成分，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效。劉家國等[5]研究表明，調(diào)整氣血為主要藥理作用的中藥組方能夠改善血液運(yùn)氧能力，從而提高蛋雞的生產(chǎn)性能。丹參作為佐藥，輔佐益母草和丹參一起使鵪鶉的生殖機(jī)能保持較高的興奮性，丹參主治月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉經(jīng)痛、胸腹刺痛、心煩不眠、肝脾腫大、心絞痛等[6]，藥理作用十分廣泛。

中藥口服液是當(dāng)前中藥生產(chǎn)中新興的，由中藥湯劑為基礎(chǔ)發(fā)展而來的熱門劑型，具有起效快，作用明顯，方便攜帶，便于保存等優(yōu)點(diǎn)[7]。相較于西藥以及抗生素，本試驗(yàn)選擇中藥制備提高老年鵪鶉產(chǎn)蛋性能的口服液的優(yōu)勢在于：安全、副作用少，對胃腸道、肝腎的刺激性小。西藥注重藥到病除、對癥用藥，并且大多采取注射等直接將藥物送達(dá)患處，容易導(dǎo)致很多的副作用；而中藥則更注重整體的恢復(fù)，本試驗(yàn)中的益母黃丹口服液采用口服的方式，通過改善老年鵪鶉子宮和卵巢的機(jī)能，興奮下丘腦垂體性腺軸，促進(jìn)性腺激素的分泌，進(jìn)而影響蛋雞的生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)擬篩選出生產(chǎn)益母黃丹口服液的最佳制備工藝，為臨床生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 口服液的制備及工藝優(yōu)化 益母黃丹口服液以益母草、黃精、丹參三味藥為3∶2∶1組成的配方，對組方進(jìn)行料液比、煎煮時(shí)間、醇沉濃度、煎煮次數(shù)的單因素，正交實(shí)驗(yàn)的工藝優(yōu)化，得出口服液的最優(yōu)制備方法。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)試劑 益母草、黃精、丹參(均購于四川成都溫江惠民大藥房，經(jīng)鑒定均符合《中國藥典》2015 年版一部的要求)；丹參藥材對照品(購自成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-D-008)；黃精藥材對照品(購自成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-H-005)；丹酚酸B(購自成都瑞芬思生物科技有限公司，D-012-190312)；益母草堿(購自成都瑞芬思生物科技有限公司，Y-065-181216)。

1.2.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 UV1100型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)、XC-110A型超聲波清洗器(濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司)、PWC184電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司)、紫外分析儀(鄭州豫華儀器制造有限公司)、硅膠G薄層板、BP211S型電子分析天平(北京Sartorius天平有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 口服液的制備工藝 將益母草15 g，黃精10 g，丹參5 g三味中藥放入1000 mL燒杯中，加14倍蒸餾水浸泡0.5 h后，進(jìn)行煎煮。取液靜置，用8層紗布濾過，合并濾液并濃縮，將濃縮后的藥液放涼后，加入乙醇進(jìn)行醇沉。將通過醇沉后的藥液攪拌均勻后靜置于5 ℃冰箱24 h，隨后置于離心機(jī)離心3000 r/ min×10 min，取出上層濾液，棄去殘?jiān)?。加一定量蒸餾水置于濾液中，使藥液中原生藥含量達(dá)到1 g/mL。向藥液中加入適量防腐劑，攪拌均勻，用0.2% NaOH調(diào)PH值使藥液PH值在5-7之間。將所制藥液進(jìn)行分裝，滅菌即可[8]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取鹽酸益母草堿0.6 mg，溶于25 mL流動相中，搖勻。制得0.024 mg/mL對照品溶液。分別取對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL溶于5 mL動相中，分別搖勻，其濃度分別為0.0024 mg/mL、0.0048 mg/mL、0.0072 mg/mL、0.0096 mg/mL、0.024 mg/mL、0.0024 mg/mL的對照品溶液。在277 nm的波長處測定吸光度， 以吸光度 (A)為縱坐標(biāo)，濃度 (C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-11]。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 以蒸餾水為提取溶劑，分別料液比、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、醇沉分?jǐn)?shù)做單因素實(shí)驗(yàn)考察。進(jìn)行單因素水平篩選時(shí)，控制其余三個(gè)因素不變，其中進(jìn)行煎煮時(shí)間水平篩選時(shí)，乙醇濃度為60%，煎煮3次，料液比1∶14；進(jìn)行醇沉體積分?jǐn)?shù)水平篩選時(shí)[12]，煎煮時(shí)間為1.5 h，煎煮3次，料液比1∶14；進(jìn)行煎煮次數(shù)水平篩選時(shí)，乙醇濃度為50%，煎煮時(shí)間為1.5 h，料液比1∶14；進(jìn)行料液比水平篩選時(shí)，煎煮時(shí)間1.5 h，乙醇濃度為60%，煎煮3次。其余條件均按照制備工藝制成相應(yīng)的口服液，并按照上述1.3.2含量測定方法測定各自鹽酸益母草堿含量。

1.3.4 正交試驗(yàn) 更好地優(yōu)化制備工藝，以益母草中益母草堿為指標(biāo)，選取單因素試驗(yàn)三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，根據(jù)表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，并按照上述1.3.2含量測定方法測定各自鹽酸益母草堿含量。

表1 影響含量的因素試驗(yàn)Tab 1 Factors Affecting Content Test

1.3.5 口服液定性檢測 益母草堿的定性試驗(yàn)：吸取口服液10 mL，揮干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，離心，取上清液作為供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，加無水乙醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在105 ℃加熱15 min，放冷，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10 ∶1)混合溶液至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

吸取口服液3 mL，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，抽濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃精對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)乙酸乙酯一甲酸(5∶2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按1.3.2方法，以鹽酸益母草堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-益母草堿質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程：y = 3.3x + 2.4821，R2=0.9992，表明鹽酸益母草堿質(zhì)量濃度在0.002～0.025 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 鹽酸益母草堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of Leonurus hydrochloride

2.2 優(yōu)化工藝結(jié)果

2.2.1 單因素水平篩選 在考察煎煮時(shí)間單因素試驗(yàn)中，以煎煮次數(shù)3次，醇沉分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶14，煎煮時(shí)間水平為0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余條件均按照制備工藝進(jìn)行。制成的口服液按照1.3.2方法檢測，結(jié)果如圖2所示：

圖2 煎煮時(shí)間水平含量曲線Fig 2 Horizontal content curve of decocting time

在考察煎煮次數(shù)單因素試驗(yàn)中，以煎煮時(shí)間1.5 h，醇沉分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶14，煎煮次數(shù)水平為1次、2次、3次、4次，其余條件均按照制備工藝進(jìn)行。制成的口服液按照1.3.2方法檢測，結(jié)果如圖3所示：

在考察醇沉分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)中，以煎煮時(shí)間1.5 h，煎煮次數(shù)3次，料液比1∶14，醇沉分?jǐn)?shù)水平為40%、50%、60%、70%，其余條件均按照制備工藝進(jìn)行。制成的口服液按照1.3.2方法檢測，結(jié)果如圖4所示：

圖4 乙醇分?jǐn)?shù)水平含量曲線Fig 4 Ethanol fraction level content curve

在考察料液比單因素試驗(yàn)中，以煎煮時(shí)間1.5 h，煎煮次數(shù)3次，醇沉分?jǐn)?shù)60%，料液比水平為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，其余條件均按照制備工藝進(jìn)行。制成的口服液按照1.3.2方法檢測，結(jié)果如圖5所示：

圖5 料液比水平含量曲線Fig 5 Material liquid ratio horizontal content curve

經(jīng)單因素試驗(yàn)篩選，得出最佳煎煮時(shí)間為1.5 h、最佳煎煮次數(shù)為2次、最佳醇沉分?jǐn)?shù)為60%、最佳料液比為1∶14。為了更好地優(yōu)化制備工藝，需對此四種因素進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，但由于料液比對試驗(yàn)結(jié)果的影響較小，于是選用煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和醇沉分?jǐn)?shù)三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選 按照表1 中的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以鹽酸益母草堿含量為指標(biāo)，結(jié)果見表3。

從上表的數(shù)據(jù)分析可知：根據(jù)極差分析，對益母黃丹口服液中鹽酸益母草堿含量影響的因素的順序?yàn)椋篊>B>A，即煎煮次數(shù)、醇沉分?jǐn)?shù)、煎煮時(shí)間。通過正交表確定最佳的制備方案為：煎煮1.5 h，煎煮3次，醇沉分?jǐn)?shù)50%。

表2 正交試驗(yàn)鹽酸益母草堿含量結(jié)果Tab 2 content results of Leonurus hydrochloride in orthogonal test

表3 益母黃丹口服液正交試驗(yàn)表Tab 3 Orthogonal test of Yimu Huangdan oral liquid

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了確定正交試驗(yàn)確定的條件是否為最佳工藝，按照2.2.2確定的最佳制備方案A2B3C1進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，鹽酸益母草堿的含量分別為1.28、1.31、1.21 mg，平均值為1.26 mg，RSD為4.05%，表明該提取條件穩(wěn)定可行，具有重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，確定最佳的制備方案為：煎煮1.5h，煎煮3次，醇沉分?jǐn)?shù)50%。

表4 正交工藝驗(yàn)證Tab 4 Orthogonal process validation

2.3 定性測定結(jié)果

2.3.1 益母草定性檢測結(jié)果 如圖6所示，供試品與對照藥材在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。益母黃丹口服液中含有益母草成分。

1：供試品；2：對照品1: Test article; 2: control article圖6 益母草定性鑒別圖Fig 6 Qualitative identification of Leonurus japonicus

2.3.2 黃精定性測定結(jié)果 如圖所示，供試品與對照藥材在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。益母黃丹口服液中含有黃精成分。

1：供試品；2：對照藥材1: Test article; 2: reference medicine圖7 黃精定性鑒別圖Fig 7 Qualitative identification of Polygonatum

3 討論與結(jié)論

3.1 試驗(yàn)考察因素的確定 益母黃丹口服液制備工藝受多種因素影響，在進(jìn)行口服液制備工藝試驗(yàn)前，參考張學(xué)謙等[13]益母草的提取工藝研究以及劉清華等[14]多花黃精中總黃酮提取工藝優(yōu)化及可視化分析中，確定了本試驗(yàn)的考察因素即：煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、醇沉分?jǐn)?shù)、料液比。通過單因素水平篩選試驗(yàn)，得出煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、醇沉濃度、料液比變量曲線。但以圖4所示可知，料液比對口服液制備工藝影響甚微，其中以1∶14適宜。分析其原因，可能是料液比梯度變化較小，對藥物有效成分溶出影響不大。因此，在下一步進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，則只選取煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、醇沉濃度作為考察因素。

3.2 煎煮次數(shù)對口服液的影響 在煎煮過程中，隨著煎煮次數(shù)的增多，更多的有效成分從藥材中提取出來，但同時(shí)也會引起非有效成分的溶出和濃縮時(shí)間的加長。在確立最佳煎煮次數(shù)的單因素試驗(yàn)中，煎煮2次相較于煎煮1次，鹽酸益母草堿中含量提升了近1倍。而后，隨著煎煮次數(shù)的增多，鹽酸益母草堿的含量稍有降低。在錢愛軍[15]的研究中表明，一般情況下煎煮次數(shù)為2次，煎煮次數(shù)過多不僅提取的有效成分不高而且也增加工藝成本。此外，煎煮次數(shù)過多會導(dǎo)致濃縮時(shí)間增長，引起有效成分揮發(fā)。

3.3 煎煮時(shí)間對口服液的影響 在確立最佳煎煮時(shí)間單因素試驗(yàn)中，由圖1顯示可知，0.5～1.5 h時(shí)間段中隨著煎煮時(shí)間的增多，鹽酸益母草堿含量不斷增加，但在煎煮2 h后，含量明顯減少。煎煮過程是中藥材中有效成分不斷溶出的過程，但當(dāng)藥材本身與藥液中有效濃度平衡時(shí)，這種擴(kuò)散運(yùn)動就會形成動態(tài)平衡[16]。過短的煎煮時(shí)間可能導(dǎo)致有效成分溶出不充分，但可通過多次煎煮補(bǔ)充。過長的煎煮時(shí)間可能導(dǎo)致有效成分的揮發(fā)和非有效成分的溶出。非有效成分的溶出，可能引起在醇沉或離心時(shí)夾雜著有效成分的沉淀。

3.4 醇沉對口服液的影響 醇沉法是最常見的藥物提取方法，但也會導(dǎo)致大量有效成分損失的情況。在楊建春等[17]的研究中表明，益母草口服液在低溫下醇沉?xí)钩善焚|(zhì)量有較大幅度的提高，放置過程不會析出沉淀。除了醇沉方法以外，劉健等[18]指出，出現(xiàn)了如：超臨界流體提取法、酶解提取法、超聲波提取法等提取新工藝。新工藝提高了藥物的提取率，也保證了中藥口服液的穩(wěn)定性和藥物效果，但是有工藝復(fù)雜、成本高等問題，在獸藥中的應(yīng)用范圍亟待擴(kuò)大。

益母黃丹口服液雖以鹽酸益母草堿為主要成分，但也包含許多多糖成分，容易因醇沉分?jǐn)?shù)不合適導(dǎo)致將藥物中的多糖隨雜質(zhì)流失。陳健岳等[19]在研究中表明，在醇沉過程中，一般濃縮藥液含醇量在50%～ 60%可以除去淀粉，其它多糖一般在此濃度也開始沉淀。其研究結(jié)果與本試驗(yàn)一致。在確定醇沉分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)中，結(jié)果表明50%～60%含量最多，超過60%后有效成分含量明顯減少。試驗(yàn)最終確定的50%醇沉分?jǐn)?shù)既可以保障口服液中的大多數(shù)黃精多糖的含量，也提高了口服液的穩(wěn)定性和澄清度。

3.5 最佳制備工藝的確立 經(jīng)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，最佳煎煮時(shí)間為1.5 h、最佳煎煮次數(shù)為2次、最佳醇沉分?jǐn)?shù)為60%，此結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果不同。于是，根據(jù)兩種方案，再進(jìn)行一次對比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，但單因素試驗(yàn)結(jié)果條件所制備的口服液中鹽酸益母草含量平均為1.24 mg較正交試驗(yàn)結(jié)果條件制成的口服液中的1.31 mg少。因此，確立最佳制備方案為煎煮時(shí)間1.5 h、煎煮次數(shù)3次，醇沉分?jǐn)?shù)50%。

3.6 結(jié)論 益母黃丹口服液由益母草、黃精、丹參3∶2∶1研制而成，其最優(yōu)制備工藝為煎煮時(shí)間1.5 h，煎煮3次，醇沉分?jǐn)?shù)50%。制備成的口服液呈深褐色，味苦，澄清透明，色澤均勻，無明顯雜質(zhì)沉淀，紫外分光光度法能測定口服液中益母草堿含量。薄層色譜中益母草、黃精斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。