合成生物技術(shù)制備脂肪族二元胺的研究進展

王昕，王靜，陳可泉，歐陽平凱

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇省國家先進材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京211816）

脂肪族二元胺作為基礎(chǔ)化學(xué)品，在聚酯、聚氨酯、聚酰胺等高分子材料的合成中占有重要地位［1-2］。2020 年僅聚酰胺類高分子材料的全球市場預(yù)計可達970萬噸［3］，高分子材料廣闊的市場空間使得對材料單體的需求日益增大。然而，這些材料單體大多通過化學(xué)法合成，存在原料依賴化石資源、合成過程污染嚴重、環(huán)境安全隱患大等問題，尤其化學(xué)合成二元胺的核心技術(shù)長期被國外跨國公司壟斷，已成為我國相關(guān)高分子材料領(lǐng)域“卡脖子”的重要因素。以自然界中可再生資源為原料通過生物制造合成二元胺，具有過程綠色、環(huán)境友好、資源節(jié)約等優(yōu)點，且制備出的生物基材料不僅可以取代傳統(tǒng)材料，性能還有望超越傳統(tǒng)材料，未來潛力巨大。同時，生物制造合成二元胺工藝的開發(fā)可打破我國高分子材料領(lǐng)域?qū)膺M口的長期依賴，是我國生物制造國家發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分。

賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有一個羧基和兩個氨基，被認為是合成C3～C5脂肪族二元胺（1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺）的理想前體化合物。當前，英國帝斯曼、中國科學(xué)院微生物研究所、南京工業(yè)大學(xué)、上海凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司、寧夏伊品生物科技股份有限公司、日本味之素株式會社等國內(nèi)外研究單位和公司均開展了大量的生物基二元胺制備研究［4］，但大多利用靜息細胞轉(zhuǎn)化法以氨基酸為原料催化脫羧合成，成本較高［5-6］。開發(fā)以糖類等生物質(zhì)為原料直接發(fā)酵合成二元胺的工藝，可進一步降低二元胺的生產(chǎn)成本，是實現(xiàn)二元胺規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵，近年來受到廣泛關(guān)注。

隨著合成生物技術(shù)的快速發(fā)展，人類通過設(shè)計、合成和組裝代謝途徑，改造微生物產(chǎn)生新的化合物，構(gòu)建高效的細胞工廠，使得生物燃料、醫(yī)藥、化學(xué)品等的一系列產(chǎn)品的生物制造成為可能［7］。利用合成生物學(xué)技術(shù)，通過對堿性氨基酸代謝途徑的設(shè)計改造，1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺等C3～C5脂肪族二元胺的生物合成不斷取得新的進展。本文重點關(guān)注了C3～C5的脂肪族二元胺的生物合成途徑，介紹了合成生物學(xué)工具在構(gòu)建和優(yōu)化工程細胞合成二元胺，以及提高產(chǎn)品合成過程經(jīng)濟性方面的應(yīng)用，綜述了國內(nèi)外生物基二元胺合成領(lǐng)域取得的突出進展，展望了未來生物基二元胺菌株改造的重點方向。

1 C3～C5脂肪族二元胺的生物合成途徑

在生物體內(nèi)，C3～C5脂肪族二元胺1，3-丙二胺、1，4-丁二胺和1，5-戊二胺的合成均衍生于堿性氨基酸（賴氨酸、鳥氨酸或精氨酸）的代謝途徑［8］。當前，已發(fā)現(xiàn)模式菌株大腸桿菌具有直接合成1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的能力，但產(chǎn)量極微。而常見的氨基酸生產(chǎn)宿主谷氨酸棒狀桿菌缺乏二元胺的天然合成能力，因此了解微生物合成二元胺的代謝途徑，對高效二元胺細胞工廠的構(gòu)建至關(guān)重要。

1.1 1，5-戊二胺的生物合成途徑

在微生物體內(nèi)，1，5-戊二胺是通過賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成的［9］。對于賴氨酸的合成，在微生物中存在兩種不同的途徑：始于α-酮戊二酸和乙酰CoA 的α-氨基己二酸途徑（AAA）和始于天冬氨酸的二氨基庚二酸途徑（DAP）。其中AAA途徑主要存在于高等真菌和古生菌中，具有2種變異途徑；而DAP 途徑有4 種不同的變異途徑，主要存在于細菌和植物。在常見的賴氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中，都通過DAP 途徑合成賴氨酸，但催化路徑有所差異，如圖1所示，谷氨酸棒狀桿菌中既可以通過二氨基庚二酸脫氫酶（DDH） 直接催化六氫吡啶二羧酸轉(zhuǎn)化為二氨基庚二酸，也可以通過DapD、DapC、DapE、DapF 經(jīng)四步催化完成轉(zhuǎn)化，而在大腸桿菌中需要DapD、DapC、DapE、DapF 經(jīng)四步催化形成二氨基庚二酸，進一步轉(zhuǎn)化合成賴氨酸［9］。

圖1 C3～C5脂肪族二元胺的生物合成途徑［8-13］（實線箭頭為一步代謝途徑，虛線箭頭為一步以上代謝途徑。綠色為1，3-丙二胺合成途徑，紫色為1，4-丁二胺合成途徑，藍色為1，5-戊二胺合成途徑）Fig.1 The biosynthetic pathway of the aliphatic diamines with 3～5 carbon atoms(The solid arrows indicate one-step metabolic pathways,and the dotted arrows indicate multiple-step metabolic pathways.The green square represents the synthetic pathway of 1,3-propanediamine,the purple square represents the synthetic pathway of 1,4-butanediamine synthesis route,and the blue square represents the synthetic pathway of 1,5-pentanediamine)

1.2 1，4-丁二胺的生物合成途徑

1，4-丁二胺在微生物體內(nèi)的合成途徑有兩種，包括鳥氨酸脫羧途徑和精氨酸脫羧途徑［10］。如圖1所示，L-鳥氨酸和L-精氨酸的生物合成途徑始于TCA循環(huán)中間體α-酮戊二酸（α-KG）。谷氨酸脫氫酶（GDH）將α-KG生物轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸后，在N-乙酰谷氨酸合酶（ArgJ）、N-乙酰谷氨酸激酶（ArgB）、N-乙酰-γ-谷氨酰氨基-磷酸還原酶（ArgC）、乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ArgD）和L-鳥氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（ArgE）一系列酶的催化作用下生成L-鳥氨酸。L-鳥氨酸可進一步在L-鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶（ArgF）、精氨酸琥珀酸酯合酶（ArgG）、精氨酸琥珀酸裂解酶（ArgH）和L-鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶I（ArgI）的催化作用下生成L-精氨酸［11-12］。以鳥氨酸為前體，在鳥氨酸脫羧酶的催化作用下，可以一步合成1，4-丁二胺。而以精氨酸為前體，通過精氨酸脫羧酶和胍丁胺酶（SpeB）兩步催化產(chǎn)生1，4-丁二胺［10］。

1.3 1，3-丙二胺的生物合成途徑

1，3-丙二胺的生物合成途徑僅在極少數(shù)微生物中發(fā)現(xiàn)，包括兩條：假單胞菌屬中的C5途徑和不動桿菌屬中的C4途徑［13］。如圖1 所示，在C5途徑中，以L-谷氨酸為前體，通過一系列酶催化反應(yīng)，經(jīng)鳥氨酸或精氨酸合成1，4-丁二胺，進而在亞精胺合成酶（SpeE）的催化作用下合成亞精胺，亞精胺在亞精胺脫氫酶（SpdH）的作用下合成1，3-丙二胺。在C4途徑中，以L-天冬氨酸為前體生成天冬氨酸半醛，進而在2-酮戊二酸-4-氨基轉(zhuǎn)移酶（DAT）、L-2，4-二氨基丁酸酯脫羧酶（DDC）的催化作用下合成1，3-丙二胺。

2 二元胺合成菌株的構(gòu)建和優(yōu)化

當前，通過對已知生物基二元胺代謝途徑進行設(shè)計、重組和組裝，在大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等菌株中，已開展了大量生物基二元胺合成的工作。利用合成生物學(xué)技術(shù)，如功能元件的進化和理性設(shè)計、調(diào)控元件的優(yōu)化、途徑的適配性調(diào)控、基因組的修飾和改造等（圖2），進一步使得產(chǎn)二元胺人工細胞的性能得到優(yōu)化。

圖2 二元胺合成細胞的優(yōu)化策略［14-48］Fig.2 The engineering strategy for the optimization of diamine synthetic cells[14-48]

2.1 二元胺合成途徑的構(gòu)建

大腸桿菌存在天然的1，5-戊二胺和1，4-丁二胺代謝途徑，通過對代謝途徑中關(guān)鍵功能元件的表達調(diào)控以及旁支代謝途徑的敲除，實現(xiàn)了大腸桿菌對1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的發(fā)酵生產(chǎn)。2011年，Qian等［14］在E.coliW3110 中通過過表達賴氨酸脫羧酶（CadA），同時抑制與1，5-戊二胺降解相關(guān)的代謝途徑，在30 h 的發(fā)酵后獲得9.6 g/L 1，5-戊二胺，生產(chǎn)速率為0.32 g/（L·h），葡萄糖轉(zhuǎn)化率僅為0.12 g/g；2009 年，韓國Sang Yup Lee 研究團隊［15］首次通過過表達鳥氨酸脫羧酶SpeC/SpeF、敲除SpeE、亞精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（SpeG）以及1，4-丁二胺分解代謝基因puuA阻斷1，4-丁二胺的降解和利用途徑、敲除鳥氨酸代謝的旁支途徑、過表達鳥氨酸合成途徑相關(guān)基因等策略，最終獲得了基因工程菌株在6.6L 反應(yīng)器規(guī)模下基于葡萄糖分批補料策略，1，4-丁二胺產(chǎn)量達24.2g/L。

以谷氨酸棒狀桿菌為宿主，通過對異源二元胺合成途徑的組裝，構(gòu)建獲得了產(chǎn)1，5-戊二胺、1，4-丁二胺的重組谷氨酸棒狀桿菌。2007 年Mimitsuka 等［16］通過將來源于大腸桿菌的CadA 整合到谷氨酸棒狀桿菌的基因組上，成功實現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1，5-戊二胺，產(chǎn)量達2.6 g/L。2010 年，德國的Schneider 和Wendisch［10］首次在谷氨酸棒狀桿菌中分別構(gòu)建了依賴于鳥氨酸脫羧酶和精氨酸脫羧酶的1，4-丁二胺合成途徑，發(fā)現(xiàn)基于鳥氨酸脫羧酶的1，4-丁二胺途徑具有更高的合成效率，實現(xiàn)了1，4-丁二胺在谷氨酸棒狀桿菌中的發(fā)酵合成。

大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌均缺乏1，3-丙二胺的天然合成途徑，2015年，韓國的Sang Yup Lee課題組［13］以大腸桿菌為宿主細胞，通過構(gòu)建1，3-丙二胺合成的C4途徑，首次實現(xiàn)了1，3-丙二胺的異源合成。在該項工作中，研究人員采用基于生物信息學(xué)的全基因組通量分析技術(shù)對1，3-丙二胺合成的C4途徑和C5途徑進行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明C4途徑具有更高的1，3-丙二胺合成效率。進而在大腸桿菌中過表達來源于鮑曼不動桿菌的dat基因和ddc基因，實現(xiàn)了1，3-丙二胺在大腸桿菌中的生物合成［13］。而1，3-丙二胺合成途徑在谷氨酸棒狀桿菌中的構(gòu)建，當前還未有研究涉及。

2.2 底盤細胞產(chǎn)品降解途徑的解析和改造

底盤細胞基因組上與產(chǎn)品降解、利用等相關(guān)冗余基因的存在，顯著影響產(chǎn)品的產(chǎn)量。合成生物學(xué)研究者們通過將系統(tǒng)生物學(xué)分析和高效的基因組編輯策略相結(jié)合，實現(xiàn)了對大腸桿菌中與1，4-丁二胺、1，5-戊二胺降解相關(guān)功能元件的挖掘，進一步通過基因敲除技術(shù)，實現(xiàn)了冗余基因的刪減，提高了產(chǎn)品的合成。Kind 等［17］發(fā)現(xiàn)N-乙酰戊二胺是谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵合成1，5-戊二胺的主要副產(chǎn)物，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了基因組上17 個可能相關(guān)的乙?；福Y(jié)合多基因敲除實驗，證實了NCgl1469 編碼的乙?；甘谴呋?，5-戊二胺乙?；年P(guān)鍵酶，該基因的缺失可使得1，5-戊二胺產(chǎn)量提高11%。同樣，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和系統(tǒng)的基因敲除技術(shù)，Nguyen等［18］發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌中的cg1722基因與1，4-丁二胺的乙?；嚓P(guān)，該基因的缺失可使1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高41%。此外，在大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)乙酰化酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸二元胺連接酶等多個同二元胺降解和利用相關(guān)的途徑，為底盤細胞的基因組改造提供了指導(dǎo)。

2.3 功能元件的設(shè)計與改造

人工細胞工廠構(gòu)建中組成代謝途徑的酶、控制基因表達強度的啟動子以及調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控因子等是合成生物系統(tǒng)中最簡單、最重要的生物元件，對結(jié)構(gòu)元件與調(diào)控元件的解析與改造也是優(yōu)化人工細胞工廠性能的關(guān)鍵。

2.3.1 結(jié)構(gòu)元件的篩選、設(shè)計與改造

脫羧酶，包括賴氨酸脫羧酶（LDC）、鳥氨酸脫羧酶（ODC）、精氨酸脫羧酶（ADC）、DDC 等作為二元胺合成過程中的關(guān)鍵功能元件，其活性對二元胺的合成至關(guān)重要。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得多樣化元件的挖掘成為可能。與1，3-丙二胺合成相關(guān)的DDC 當前僅在鮑曼不動桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、產(chǎn)氣克萊勃氏桿菌等微生物中發(fā)現(xiàn)［19-22］，而與1，5-戊二胺、1，4-丁二胺合成相關(guān)的LDC、ADC、ODC 已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)，其中對大腸桿菌來源的酶研究最為深入。在大腸桿菌中，LDC、ADC 和ODC 均存在誘導(dǎo)型和組成型兩種形式。其中誘導(dǎo)型的LDC、ADC 和ODC 分別由cadA、adiA和speF編碼，而組成型的由ldcC、speA和speC編碼［23-29］。不同來源或形式的脫羧酶對pH、溫度等環(huán)境的耐受性以及催化活性均有所差異，因此脫羧酶的選擇是影響二元胺合成的關(guān)鍵因素之一。例如，在1，4-丁二胺合成過程中，組成型的SpeC 比誘導(dǎo)型的SpeF更有利于1，4-丁二胺的合成［10］，同時在谷氨酸棒狀桿菌對比7 個不同來源的組成型SpeC，發(fā)現(xiàn)來源于陰溝腸桿菌的SpeC 表現(xiàn)出最高的1，4-丁二胺合成能力［30］；對于1，5-戊二胺，誘導(dǎo)型的CadA比組成型的LdcA表現(xiàn)出更高的催化活力［27］。

為了提高產(chǎn)品合成的經(jīng)濟效益，推動產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，對酶的活性和穩(wěn)定性提出了更高的要求。然而，自然界中天然存在的酶通常不能滿足需求。采用定向進化和理性設(shè)計等策略，進行元件的重新改造，可有效提高結(jié)構(gòu)元件各種功能屬性，滿足細胞工廠的構(gòu)建需求。Wang 等利用易錯PCR 和DNA 改組技術(shù)產(chǎn)生了蜂窩哈夫尼亞菌來源LDC 的突變文庫，篩選獲得了具有更高催化活性的酶，使得1，5-戊二胺的合成提高了約1.5倍［31］。Hong等［32］采用基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計策略設(shè)計獲得了賴氨酸脫羧酶突變體CadAF14C/K44C，顯著提高了CadA 對pH 的耐受性以及熱穩(wěn)定性，進一步篩選獲得的突變體CadAF14C/K44C/L7M/N8G使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了1.3 倍，同時降低了發(fā)酵過程中pH 的調(diào)控成本。同樣，為了優(yōu)化1，4-丁二胺的合成，Choi 等［33］對大腸桿菌來源的SpeC 進行了理性設(shè)計和改造，大大提高了酶的底物親和性，使得酶的活力提高了62.5 倍。Hong 等［34］基于分子結(jié)構(gòu)和蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)計構(gòu)建底物特異性增強的酶突變體，使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高了4 倍。

2.3.2 啟動子元件的優(yōu)化

原核基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此啟動子、RBS 等生物元件在途徑的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。原核生物的啟動子元件有誘導(dǎo)型和組成型兩種。為了豐富基因的表達調(diào)控策略，合成生物學(xué)者已經(jīng)開展一系列研究，通過挖掘多樣的天然啟動子、人工設(shè)計合成非天然啟動子，建立了多樣的啟動子元件庫，使得途徑構(gòu)建過程中基因表達強度的精確調(diào)控成為可能。當前，在大腸桿菌中開展二元胺生物合成的基礎(chǔ)研究工作時，多采用IPTG 誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子。而在谷氨酸棒狀桿菌中組裝二元胺合成途徑時，為了進一步提高經(jīng)濟效益，避免昂貴誘導(dǎo)物的添加，合成生物學(xué)研究者們設(shè)計了多個不同的組成型啟動子，用于調(diào)控基因的表達。Oh等［35］在利用谷氨酸棒狀桿菌合成1，5-戊二胺時，采用6個不同的人工合成的組成型啟動子調(diào)控異源賴氨酸脫羧酶（LdcC）的表達，篩選獲得了最有利于1，5-戊二胺合成的啟動子PH30。利用上述的表達調(diào)控策略，Kim 等［36］在工業(yè)生產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌中組裝1，5-戊二胺合成途徑，使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量達103.78 g/L，為當前發(fā)酵法生產(chǎn)1，5-戊二胺的最高水平。在1，4-丁二胺合成過程中，Schneider 等［37］通過優(yōu)化啟動子和RBS 元件，建立了ArgF 精確調(diào)控策略，使得谷氨酸棒狀1，4-丁二胺產(chǎn)量提高到19 g/L，為當前谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵合成1，4-丁二胺的最高水平。

2.3.3 調(diào)控因子的解析與改造

除產(chǎn)品自身的合成和降解途徑外，細胞內(nèi)存在其他可能影響產(chǎn)品合成的基因或轉(zhuǎn)錄因子。近年來，合成生物學(xué)者開發(fā)基于sRNA、CRISPR/Cas等策略的高通量基因組編輯技術(shù)，為調(diào)控元件的高效挖掘提供了強有力的技術(shù)支撐。其中，sRNA是細菌重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，廣泛參與細菌各方面的調(diào)控功能。通過模塊化的合成型RNA分子，RNA 介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機制可在全基因組范圍內(nèi)有效篩選靶基因和精細控制靶基因的表達水平，優(yōu)化產(chǎn)品的合成。2013 年，Na 等［38］通過設(shè)計合成型sRNA，使用含有130 個sRNA 的文庫，在大腸桿菌中篩選發(fā)現(xiàn)murE基因的抑制可使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高55%。2017 年，Noh 等［39］開發(fā)了通過調(diào)節(jié)合成型sRNA 表達水平微調(diào)基因表達水平的敲低系統(tǒng)，通過對75 個合成型sRNA-啟動子組合的文庫的篩選，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)glnA和argF的抑制可有效提高1，4-丁二胺的合成，產(chǎn)量達42.3g/L，為當前以大腸桿菌為宿主發(fā)酵合成1，4-丁二胺的最高水平。以上研究所使用的人工合成型sRNA 微調(diào)靶基因的技術(shù)，同基因敲除策略和其他大規(guī)模靶標識別策略相比，具有操作簡單、易于實施、通量高等優(yōu)點，可較好地推廣應(yīng)用于優(yōu)良生產(chǎn)菌株的開發(fā)。

此外，細胞內(nèi)存在眾多的全局轉(zhuǎn)錄因子，如σ因子，這些蛋白質(zhì)控制了細胞內(nèi)大量基因的轉(zhuǎn)錄表達，如果對這些蛋白質(zhì)進行改造，可能產(chǎn)生多種復(fù)雜表型， 用于人工細胞工廠的性能優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌合成1，4-丁二胺的過程中，可引起轉(zhuǎn)錄因子Cya、RpoS、FecI和Fis表達量的提高，其中胞內(nèi)壓力響應(yīng)RNA 聚合酶σ 因子RpoS 是一種眾所周知的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可控制大腸桿菌中10%以上基因的表達，通過對RpoS 的敲除，可顯著提高大腸桿菌1，4-丁二胺的合成能力［15］。

2.3.4 功能模塊的適配性優(yōu)化

人工細胞中模塊之間的適配性是細胞工廠穩(wěn)定發(fā)揮功能的必要因素之一，也是合成生物學(xué)領(lǐng)域要解決的核心關(guān)鍵問題之一。不同人工合成功能模塊在同一底盤生物中的存在，引發(fā)的還原力不平衡、中間代謝物積累、前體供給不足等不適配問題常導(dǎo)致生物基產(chǎn)品合成效率低下，是合生生物學(xué)研究的主要困難。采用系統(tǒng)代謝工程策略，通過解析影響細胞工廠效率的關(guān)鍵代謝機制，將多種輔助生物模塊，如底物轉(zhuǎn)運模塊、產(chǎn)物轉(zhuǎn)運模塊、輔因子轉(zhuǎn)變模塊等與產(chǎn)品合成模塊在細胞中進行系統(tǒng)優(yōu)化，是解決代謝途徑的適配性問題、提高細胞工廠性能的有效手段。

（1）輔因子模塊 DDC、ODC、ADC 和LDC均為依賴于5-磷酸吡哆醛（PLP）的脫羧酶［40］。PLP的高效供給是維持脫羧酶活力的必要因素，顯著影響二元胺的合成效率。當前，已鑒定獲得兩條PLP 的從頭合成途徑［41-42］：一條是由7 步酶催化組成的5-磷酸脫氧木酮糖途徑［43］；另一條為5-磷酸核糖途徑，由PdxST 復(fù)合體催化［44］。在大腸桿菌中過表達天然5-磷酸脫氧木酮糖途徑中的關(guān)鍵基因或組裝異源的5-磷酸核糖途徑均可有效增強胞內(nèi)PLP 的合成［45］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的大腸桿菌中，南京工業(yè)大學(xué)的Chen等［46］通過在大腸桿菌中組裝異源的5-磷酸核糖途徑增強PLP的供給，使得1，5-戊二胺的合成提高了2.9倍。

賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的合成途徑依賴于ATP 和NAD（P）H，如每合成1 分子的賴氨酸，需要消耗2 分子的ATP 和4 分子的NADPH。ATP 和NAD（P）H 輔因子模塊的適配性調(diào)控有利于二元胺的生物合成。在1，4-丁二胺合成過程中，Li 等［9］發(fā)現(xiàn)抑制胞內(nèi)ATP 消耗的酶（CarB、XylB、AccDA、PurL、CoaA、PknG 和PanC2） 和NADPH 消 耗 的 酶（Dxr、 AroE 和TrxB） 增強胞內(nèi)ATP 和NADPH 的供給可顯著增加1，4-丁二胺的合成。在產(chǎn)1，3-丙二胺的大腸桿菌中，通過增強胞內(nèi)NADPH 的供給，同時增強胞內(nèi)前體天冬氨酸的合成，1，3-丙二胺的最終產(chǎn)量達13.0 g/L［13］。

（2）物質(zhì)轉(zhuǎn)運模塊 當前，通過調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運模塊增強二元胺生產(chǎn)的研究主要集中在1，5-戊二胺和1，4-丁二胺的生物合成。南京工業(yè)大學(xué)Chen 等通過在大腸桿菌中調(diào)控賴氨酸/1，5-戊二胺反向轉(zhuǎn)運蛋白CadB 的表達，采用全細胞催化工藝，使得以賴氨酸為底物的1，5-戊二胺產(chǎn)量達221g/L［5］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的工程谷氨酸棒狀桿菌，通過異源表達大腸桿菌中的CadB 轉(zhuǎn)運模塊，使得1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了30%［47］。Kind 等［48］采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，在組裝了1，5-戊二胺合成途徑的谷氨酸棒狀桿菌中鑒定獲得了與1，5-戊二胺分泌相關(guān)的通透酶cg2893，該元件的過表達使得菌株1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了20%；進一步通過敲除賴氨酸外排蛋白NCgl1469 和LysE， 獲得工程菌株Corynebacterium glutamicumDAP-16，在葡萄糖分批補料發(fā)酵策略下，1，5-戊二胺產(chǎn)量達88 g/L［49］。Nguyen 等［18］通過轉(zhuǎn)錄組解析，同樣發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒狀桿菌中與1，4-丁二胺分泌相關(guān)的基因cgmA，該基因的過表達使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量提高了24%。Li等同樣通過過表達cgmA 轉(zhuǎn)運蛋白，并系統(tǒng)集成前體合成模塊和OdhA 調(diào)控模塊的強度優(yōu)化，使得1，4-丁二胺的產(chǎn)量達12.4 g/L［30］。以上研究證實了物質(zhì)轉(zhuǎn)運，尤其是產(chǎn)品外排模塊對提高產(chǎn)品合成的關(guān)鍵作用，然而當前有關(guān)二元胺的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)研究較少，尤其是對于谷氨酸棒狀桿菌，進一步挖掘同產(chǎn)品轉(zhuǎn)運相關(guān)的元件，對優(yōu)化工程細胞的性能至關(guān)重要。

基于以上研究，在構(gòu)建二元胺工程菌株的研究工作中，大多采用過表達或異源表達關(guān)鍵功能元件脫羧酶組裝二元胺合成途徑，進而通過增強前體合成模塊的代謝水平以及改造底盤細胞使之缺失對產(chǎn)品的利用和降解的能力的策略獲得工程細胞，在此基礎(chǔ)上，基于高通量的元件解析和篩選技術(shù)，組裝獲得了一系列同物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞調(diào)控、輔因子合成等相關(guān)的功能模塊，通過模塊間的適配性調(diào)控和系統(tǒng)集成，進一步提高了二元胺工程細胞的產(chǎn)品合成性能。

同時，當前以大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌為宿主均開展了許多二元胺的途徑構(gòu)建和合成研究。其中大腸桿菌遺傳背景清晰，易于改造，且細胞內(nèi)二元胺合成、轉(zhuǎn)運、調(diào)控等元件的研究較為成熟，是研究二元胺合成調(diào)控機制的理想宿主之一，可為二元胺在其他宿主中的改造提供指導(dǎo)。然而大腸桿菌存在氨基酸前體產(chǎn)量低、對二元胺耐受性低等問題，而谷氨酸棒狀桿菌是天然的氨基酸高產(chǎn)菌株，且對二元胺具有較高的耐受性，盡管其缺乏二元胺的天然合成途徑，基于上述系統(tǒng)生物解析和合成生物技術(shù)改造，可較好實現(xiàn)二元胺在谷氨酸棒狀桿菌中的高效生產(chǎn)，被認為是合成二元胺的理想宿主?；谝陨涎芯?，如表1 所示，重組菌株發(fā)酵合成1，5-戊二胺的最高產(chǎn)量達103.78g/L［36］，1，4-丁二胺達42.3g/L［39］，1，3-丙二胺達13.06g/L［13］，以上工作為生物基二元胺的產(chǎn)業(yè)化制備奠定了基礎(chǔ)。

表1 不同宿主合成C3～C5脂肪族二元胺最高水平對比Tab.1 The highest production level of aliphatic diamines with 3～5 carbon atoms by different hosts

3 以非糧生物質(zhì)為原料的生物基二元胺合成

第一代生物煉制以“糧食作物生物質(zhì)”為原料，存在“與人爭糧、與糧爭地”等問題，隨著糧食危機日益加劇以及糧食價格不斷攀升，以糧食為原料的生物制造正面臨嚴峻考驗。為推進生物制造的可持續(xù)發(fā)展，提高生物制造的競爭力，當前生物煉制已步入第二代以木質(zhì)纖維素原料為代表的“非糧生物質(zhì)”時代。利用合成生物學(xué)技術(shù)，開發(fā)以木質(zhì)纖維素、粗甘油等非糧生物質(zhì)為原料的二元胺生產(chǎn)菌株（圖3），對推動生物基二元胺的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

圖3 以非糧生物質(zhì)為原料的生物基二元胺合成［50-58］Fig.3 The biosynthesis of aliphatic diamines with non-food feedstock

3.1 利用木糖合成二元胺

木糖是木質(zhì)纖維素原料中含量僅次于葡萄糖的單糖，含量約為18%～30%［50］，因此，開發(fā)和研究菌株高效利用木糖轉(zhuǎn)化合成二元胺的技術(shù)，是實現(xiàn)以木質(zhì)纖維素為原料產(chǎn)業(yè)化制備二元胺的必要條件。野生型的谷氨酸棒狀桿菌無法直接利用木糖作為發(fā)酵底物，當前通過在谷氨酸棒狀桿菌中組裝和優(yōu)化木糖利用途徑，已實現(xiàn)1，5-戊二胺、1，4-丁二胺的生物合成。在已發(fā)現(xiàn)的4 種木糖代謝途徑中［51］，木糖異構(gòu)酶（XI）途徑被廣泛用于谷氨酸棒狀桿菌的木糖代謝改造。例如通過在產(chǎn)1，4-丁二胺谷氨酸棒狀桿菌中組裝XI 途徑，并對不同來源的木糖異構(gòu)酶XylA 進行篩選，重組谷氨酸棒狀桿菌代謝木糖合成1，4-丁二胺的產(chǎn)量由2.9mmol/L 增加到15.1mmol/L，同時以稻草秸稈水解液為發(fā)酵原料，成功檢測到1，4-丁二胺的合成［52］。在產(chǎn)1，5-戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌中，通過組裝來源于E. coli的XI 途徑［53］，進一步基于C13代謝通量分析和轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析獲得了影響木糖高效利用合成1，5-戊二胺的關(guān)鍵，通過系統(tǒng)改造磷酸戊糖途徑（PPP）、TCA 循環(huán)途徑、賴氨酸分泌蛋白LysE 以及1，5-戊二胺乙?；緩?，獲得的重組谷氨酸棒狀桿菌DAP-Xyl1icdGTG Peftu fbp Psod tktΔactΔlysE代謝木糖合成1，5-戊二胺的產(chǎn)量提高了54%，達103 g/L，轉(zhuǎn)化率（以物質(zhì)的量計）達32%，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價值［54］。

3.2 利用粗甘油合成二元胺

粗甘油是生物柴油和生物乙醇生產(chǎn)過程中不可避免的副產(chǎn)物，每年產(chǎn)生約6 億噸［55］。鑒于粗甘油產(chǎn)量大、成本低等特點，被認為是大規(guī)模生物生產(chǎn)過程中的理想原料［56-57］。大腸桿菌天然具有甘油代謝途徑，然而當前以大腸桿菌為宿主利用甘油生物轉(zhuǎn)化合成二元胺的研究鮮有報道。谷氨酸棒桿菌同樣具有天然的甘油代謝途徑，然而內(nèi)源甘油利用途徑中的關(guān)鍵酶甘油激酶（GlpK）和3-磷酸甘油脫氫酶（GlpD）活性低，增加基因表達強度僅允許谷氨酸棒桿菌以甘油為碳源的緩慢生長。通過在谷氨酸棒狀桿菌中組裝大腸桿菌來源的甘油代謝途徑，重組菌株可以快速利用甘油進行生長，且成功制備獲得4.7mmol/L 的1，4-丁二胺［58］。

4 生物基二元胺合成過程中CO2的原位固定

由生物脫羧催化合成二元胺的生產(chǎn)過程伴隨著大量CO2的釋放，如每生產(chǎn)1 t 1，5-戊二胺產(chǎn)生0.43t CO2。CO2的釋放不僅大大降低了產(chǎn)品的原子經(jīng)濟性，同時增加了溫室氣體的排放。南京工業(yè)大學(xué)Chen等［59］針對1，5-戊二胺合成過程中的脫羧CO2排放問題，通過構(gòu)建由丁二酸合成菌和1，5-戊二胺合成菌組成的人工多細胞體系，實現(xiàn)了賴氨酸脫羧反應(yīng)釋放CO2的固定用于丁二酸的合成，減少了CO2排放，同時該耦合體系利用產(chǎn)物1，5-戊二胺與丁二酸自身的酸堿特性互為酸堿中和劑，整個過程中實現(xiàn)酸堿的零添加；且可一步發(fā)酵合成1，5-戊二胺丁二酸鹽，用于PA54 的合成。人工合成的微生物多細胞體系已成功應(yīng)用于醫(yī)藥、能源、材料等生物基產(chǎn)品的高效合成中，上述研究通過人工多細胞體系的構(gòu)建實現(xiàn)CO2的再循環(huán)，為提高生物基二元胺合成過程的原子經(jīng)濟性提供了新思路。

此外，利用合成生物學(xué)技術(shù)，在產(chǎn)品合成菌株中增強或重構(gòu)CO2固定途徑，實現(xiàn)產(chǎn)品合成過程中CO2的再循環(huán)利用，減少溫室氣體排放，是有效提高生物基產(chǎn)品合成過程原子經(jīng)濟性的策略之一，近年來受到研究者的廣泛關(guān)注（圖4）。當前，已發(fā)現(xiàn)6 個天然的CO2固定途徑，包括卡爾文循環(huán)、Wood-Ljungdahl 途徑、還原性TCA 循環(huán)途徑、3-羥基丙酸雙循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)和3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)［60］。研究者們通過在異養(yǎng)模式微生物中組裝和調(diào)控CO2固定途徑，成功實現(xiàn)了CO2的再循環(huán)利用。例如，通過在釀酒酵母異源表達卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCO） 和磷酸核酮糖激酶（PRK），成功實現(xiàn)了生物乙醇生產(chǎn)過程中CO2的原位固定，乙醇產(chǎn)量提高了10%，副產(chǎn)物甘油產(chǎn)量降低了90%［61］；通過在大腸桿菌中異源表達RuBisCO 和PRK，同時與ATP再生途徑相結(jié)合，使得蘋果酸的產(chǎn)量提高了387mmol/L［62］。證實了通過合成生物學(xué)手段實現(xiàn)CO2原位固定改善化學(xué)品生產(chǎn)的巨大潛力，為提高生物基二元胺合成過程的經(jīng)濟性，發(fā)展綠色、低碳的生物基二元胺生產(chǎn)模式提供了借鑒。

圖4 生物基二元胺合成過程CO2的原位固定Fig.4 The in situ fixation of CO2 during the synthesis of bio-based diamines

5 展 望

脂肪族二元胺作為重要的材料單體，可用于聚酰胺和聚氨酯的合成，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域。在以上的研究中，通過一系列的合成生物技術(shù)，如調(diào)控元件和功能元件的挖掘、設(shè)計與優(yōu)化、模塊的系統(tǒng)系統(tǒng)與適配性優(yōu)化、發(fā)酵原料的途徑構(gòu)建等工程策略，初步實現(xiàn)了1，3-丙二胺、1，4-丁二胺、1，5-戊二胺等產(chǎn)品的發(fā)酵制備，然而重組菌株仍存在產(chǎn)率較低的問題，無法滿足工業(yè)化需求。在未來的研究工作中如何提高工程菌株的產(chǎn)品合成能力和生物反應(yīng)過程的經(jīng)濟性，是推進生物基二元胺產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

二元胺對細胞具有毒性，其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的過量積累會對細胞生長產(chǎn)生抑制并限制了最終產(chǎn)品的合成。例如大腸桿菌在40.4g/L 1，5-戊二胺存在時生長速率下降35%［63］。谷氨酸棒狀桿菌在102g/L 的1，5-戊二胺濃度下生長速率下降約67%［64］，在66g/L 的1，4-丁二胺條件下生產(chǎn)速率下降34%［10］。然而當前對二元胺抑制機理的深入研究較少，僅在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)1，5-戊二胺的積累可能會誘導(dǎo)孔蛋白的閉合，從而引起細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收不足，影響細胞的生長和代謝。而對于谷氨酸棒狀桿菌，二元胺屬于非天然產(chǎn)物，其抑制機制研究尚未涉及。因此，明確1，5-戊二胺抑制細菌生長的機制，發(fā)掘相關(guān)抗逆元件，提高底盤細胞的二元胺耐受性是亟需解決的問題。

降低生物基二元胺生產(chǎn)過程中脫羧CO2的排放，實現(xiàn)CO2的再循環(huán)利用也是該領(lǐng)域未來所面臨的重大挑戰(zhàn)。CO2處于高度氧化的狀態(tài)，將CO2生物轉(zhuǎn)化為有機代謝產(chǎn)物的過程需要大量的能量，包括ATP 和NAD（P）H［60］。天然固碳途徑較低的酶催化效率、較高的能量需求以及氧氣敏感性等特點，目前不能滿足工業(yè)化的要求，限制了天然固碳途徑在改善產(chǎn)品合成中的應(yīng)用。近年來，研究者們利用合成生物學(xué)技術(shù)，一方面通過挖掘、設(shè)計和改造新的功能元件，提高天然固碳途徑的反應(yīng)效率，一方面人工設(shè)計合成多條低耗高效的固碳途徑，包括丙酮酸合成酶-丙酮酸羧化酶-乙醛酸（PPG）循環(huán)、丙二酰輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸（MOG）循環(huán)、丁烯酰輔酶A-乙基丙二酰輔酶A-羥基丁酰輔酶A（CETCH） 循環(huán)以及還原性甘氨酸途徑（rGly）［65-66］，為突破天然固碳途徑的效率瓶頸提供了可能。此外，納米微反應(yīng)器［67］、分子支架［68］、多酶組裝［69］等新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為CO2循環(huán)利用效率的優(yōu)化提供了新的啟發(fā)。在部分自養(yǎng)菌中，存在一種基于碳酐酶（CA）和羧酶體微區(qū)室結(jié)構(gòu)的CO2捕獲和濃縮系統(tǒng)［70］，在較低CO2濃度的環(huán)境中，可以高效捕獲胞外的CO2，胞內(nèi)羧酶體中CO2濃度是胞外環(huán)境中CO2濃度的近千倍［71］，從而通過增加固碳酶周圍的CO2濃度提高CO2固定效率。因此，如果將這些自養(yǎng)微生物中的固碳機制加以開發(fā)利用，在二元胺生產(chǎn)菌株將脫羧酶和CO2固定酶限制在亞細胞空間，構(gòu)建CO2原位固定的納米微反應(yīng)器，或利用分子支架以及多酶組裝技術(shù)，實現(xiàn)脫羧酶和固碳酶的共定位，有望提高二元胺合成過程中CO2的原位固定效率，增強二元胺合成過程的原子經(jīng)濟性。

合成生物學(xué)的快速發(fā)展，為設(shè)計構(gòu)建高效的二元胺合成細胞工廠提供了可能，通過對底盤細胞的基因組改造和性能強化、對高效調(diào)控元件和結(jié)構(gòu)元件的挖掘和改造、對二元胺合成代謝途徑的再設(shè)計和優(yōu)化，對胞內(nèi)代謝調(diào)控機制的解析和模塊的適配性調(diào)節(jié)等手段，合成生物技術(shù)有望創(chuàng)造出高效的二元胺合成人工細胞，實現(xiàn)綠色、低碳、高效的二元胺生物制造，推動生物基高分子材料領(lǐng)域的發(fā)展。