生物逆向工程設(shè)計(jì)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

陳欣懋，歐陽頎

（北京大學(xué)物理學(xué)院，北京 100871）

1 生物系統(tǒng)正向工程與逆向工程的研究方法

系統(tǒng)生物學(xué)著重關(guān)注生物系統(tǒng)的復(fù)雜相互關(guān)系［1-3］，利用非線性動(dòng)力學(xué)、復(fù)雜系統(tǒng)理論與統(tǒng)計(jì)物理等方法探索生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特性，包括生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征、動(dòng)力學(xué)特征、功能特征，以及三者之間的相互制約關(guān)系。根據(jù)研究網(wǎng)絡(luò)尺度等特點(diǎn)的不同，我們可以選擇不同的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行研究，包括離散模型、連續(xù)模型，隨機(jī)模型、確定性模型等［4］。這種根據(jù)已知的蛋白質(zhì)、基因間的相互作用構(gòu)建動(dòng)力學(xué)方程，研究系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、解釋或預(yù)測(cè)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能和現(xiàn)象的方法被稱為正向工程。然而，在更多時(shí)候，人們并不了解生物系統(tǒng)中的具體相互關(guān)系，僅能宏觀測(cè)量到系統(tǒng)具有的特定功能。出于對(duì)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的探索，研究者運(yùn)用數(shù)學(xué)物理等知識(shí)找到了可以根據(jù)網(wǎng)絡(luò)功能來研究功能背后的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的方法［5-11］。這種根據(jù)功能探尋生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的方法與正向工程的思路相反，因此被稱之為逆向工程［12-14］。

在系統(tǒng)生物學(xué)幫助我們深刻理解生物系統(tǒng)后，研究者萌發(fā)了有目的地改造生命系統(tǒng)的想法，并綜合其他學(xué)科的思想從頭設(shè)計(jì)并創(chuàng)造具有新功能的生命系統(tǒng)，合成生物學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。電子工程因自下而上的設(shè)計(jì)思路取得了重大的成功，這啟發(fā)了合成生物學(xué)借用這種思路進(jìn)行自下而上的正向工程設(shè)計(jì)，即借用電子學(xué)中數(shù)字電路設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)理念，通過理性設(shè)計(jì)，將元件組裝成器件，器件集成模塊，模塊構(gòu)建復(fù)雜的生物系統(tǒng)，最終封裝在生物體中使其成為一個(gè)能執(zhí)行預(yù)定功能的生物機(jī)器［15-17］。基因振蕩器［18］與遺傳雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)［19］是合成生物學(xué)在理論指導(dǎo)下合成的第一批生物元件，它們的實(shí)現(xiàn)表明了理性設(shè)計(jì)生物元器件的可行性，是“合成生物學(xué)的里程碑”［20］。隨后，研究者發(fā)掘出了越來越多的標(biāo)準(zhǔn)元件，并利用這些標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件構(gòu)建了多種多樣的基本邏輯門［21-26］，進(jìn)一步組裝構(gòu)建了眾多具有全新功能的生物系統(tǒng)，如具有捕食者-獵物生態(tài)系統(tǒng)特點(diǎn)的大腸桿菌生態(tài)系統(tǒng)［27］、能產(chǎn)生青蒿素的酵母細(xì)胞［28-29］、具有巴甫洛夫條件反射的細(xì)胞［30］、具有計(jì)算能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞［31］、揭示生物菌落遷徙進(jìn)化中競(jìng)爭(zhēng)規(guī)律的生物系統(tǒng)［32］、利用協(xié)同組裝實(shí)現(xiàn)復(fù)雜信號(hào)處理的酵母細(xì)胞［33］、僅有單條染色體的酵母細(xì)胞［34］等。合成生物學(xué)家在設(shè)計(jì)并創(chuàng)造這些全新生命系統(tǒng)的過程中進(jìn)一步加深學(xué)習(xí)和理解了自然生命系統(tǒng)的運(yùn)作規(guī)律。然而，這種系統(tǒng)工程化的設(shè)計(jì)思想忽視了電子系統(tǒng)與生物系統(tǒng)的顯著差異，即簡(jiǎn)單系統(tǒng)與復(fù)雜系統(tǒng)的差異。復(fù)雜系統(tǒng)設(shè)計(jì)中必須重點(diǎn)考慮的系統(tǒng)與狀態(tài)穩(wěn)定性、分叉現(xiàn)象（涌現(xiàn)現(xiàn)象）及強(qiáng)關(guān)聯(lián)性等，都是目前正向工程設(shè)計(jì)沒有考慮的。這些問題限制了合成生物學(xué)家對(duì)復(fù)雜功能生物網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)。

逆向工程研究的思路與合成生物學(xué)設(shè)計(jì)過程具有一致性，并可以解決或部分解決設(shè)計(jì)復(fù)雜系統(tǒng)所遇到的問題，這啟發(fā)了我們利用逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)的理性設(shè)計(jì)。逆向工程應(yīng)用到合成生物學(xué)，將大大降低復(fù)雜功能回路的設(shè)計(jì)難度，降低合成生物學(xué)功能回路的構(gòu)建難度。

2 逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的方法

根據(jù)數(shù)學(xué)模型的不同，逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的方法大體上可以分為基于微分方程的逆向工程和基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程。

2.1 基于微分方程的逆向工程

研究連續(xù)系統(tǒng)常用的工具是微分方程。微分方程模型是基于熱力學(xué)極限的平均場(chǎng)模型。它將分子濃度當(dāng)作連續(xù)變量，用一階常微分方程描述系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)行為，如式（1）。

式 中，x=(x1，x2，…，xi，…xn)T；p=(p1,p2,…,pi,…pn)T；f=(f1，f2，…，fi，…fn)T。xi表示節(jié)點(diǎn)i對(duì)應(yīng)的濃度，pi為模型中的參數(shù)，fi為系統(tǒng)相互關(guān)系對(duì)應(yīng)的方程形式。系統(tǒng)將根據(jù)初態(tài)和微分方程指定的約束條件在相空間中沿著確定的軌跡演化。

網(wǎng)絡(luò)窮舉是基于微分方程的逆向工程方法之一，也是逆向工程設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的較為成熟的方法。通過限定研究網(wǎng)絡(luò)尺度保留網(wǎng)絡(luò)間相互作用的復(fù)雜形式，網(wǎng)絡(luò)窮舉幫助我們尋找更多具有特定功能的未知網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，加深我們對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解和研究。研究者通過目標(biāo)功能提出相應(yīng)的模型假設(shè)與目標(biāo)函數(shù)，在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)全空間中遍歷計(jì)算所有特定節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)目標(biāo)功能和適當(dāng)?shù)木W(wǎng)絡(luò)功能評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選出全局最優(yōu)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。通常我們將網(wǎng)絡(luò)功能的魯棒性作為功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，用來衡量網(wǎng)絡(luò)功能對(duì)參數(shù)的敏感性。網(wǎng)絡(luò)的魯棒性越高，功能抵抗參數(shù)擾動(dòng)的能力就越強(qiáng)。在具體計(jì)算過程中，常用Q值表征網(wǎng)絡(luò)的魯棒性，Q值是網(wǎng)絡(luò)參數(shù)在合理的參數(shù)空間下進(jìn)行拉丁超立方隨機(jī)采樣［35］時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)功能的隨機(jī)參數(shù)的比例，滿足如式（2）條件。

式中，n為在參數(shù)空間中隨機(jī)采樣的總套數(shù)，有m套隨機(jī)參數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)功能。

網(wǎng)絡(luò)窮舉的方法因?yàn)槟芫_模擬動(dòng)力學(xué)過程，幫助我們探索具有目標(biāo)功能的未知網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用在研究網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)中，包括適應(yīng)性［36］、果蠅發(fā)育的極性建立［37］、計(jì)量響應(yīng)吻合性［38］、自組織細(xì)胞極化［39］、圖靈斑圖［40］、振蕩周期的溫度補(bǔ)償性［41］、生物濾波器［42］等。例如，在適應(yīng)性［36］ 的研究中，作者引入靈敏性（sensitivity）和適應(yīng)準(zhǔn)確性（adaptation precision）這兩個(gè)特征量來定量刻畫適應(yīng)性功能。其中，靈敏性指標(biāo)是網(wǎng)絡(luò)的響應(yīng)輸出最大值與初始輸出值的比，適應(yīng)準(zhǔn)確性是網(wǎng)絡(luò)在輸出狀態(tài)恢復(fù)穩(wěn)定后相對(duì)初始輸出的比值的倒數(shù)，用來表征輸入信號(hào)變化前后對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定輸出信號(hào)的差異。具有適應(yīng)性的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)該具有對(duì)輸入信號(hào)靈敏響應(yīng)的能力（靈敏性＞1）和準(zhǔn)確適應(yīng)的能力（適應(yīng)準(zhǔn)確性＞10）（圖1）。同時(shí)，模型假設(shè)每個(gè)節(jié)點(diǎn)有激活和非激活兩種可相互轉(zhuǎn)換的狀態(tài)，且兩種狀態(tài)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度之和是一定的。通過上述模型假設(shè)，遍歷計(jì)算所有可能的三節(jié)點(diǎn)酶促反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。在每一個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的具體計(jì)算中，研究者根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)寫出對(duì)應(yīng)調(diào)控的微分方程組，在參數(shù)空間進(jìn)行拉丁超立方隨機(jī)采樣進(jìn)而模擬動(dòng)力學(xué)過程，通過計(jì)算相應(yīng)參數(shù)下的靈敏性和適應(yīng)準(zhǔn)確性這兩個(gè)特征量，來最終確定實(shí)現(xiàn)適應(yīng)性的參數(shù)套數(shù)，即網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的Q值（圖2）。通過表征網(wǎng)絡(luò)魯棒性的Q值，研究者篩選出了能較好實(shí)現(xiàn)完美適應(yīng)的最小網(wǎng)絡(luò)，分別是帶有緩沖節(jié)點(diǎn) 的負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)（NFBLB）和非一致前饋網(wǎng)絡(luò)（IFFLP）（圖3）。

圖1 適應(yīng)性的數(shù)學(xué)描述［36］Fig.1 Mathematical description of the adaptation function [36]

雖然網(wǎng)絡(luò)窮舉的方法可以幫助我們理解網(wǎng)絡(luò)功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，但是目前計(jì)算機(jī)的計(jì)算能力限制了模型的進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)于三節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)窮舉法需要遍歷計(jì)算39=19 683個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中對(duì)于每一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)隨機(jī)參數(shù)的采樣數(shù)n=10 000 時(shí)，總計(jì)算量將達(dá)到億量級(jí)，耗時(shí)若干天；對(duì)于四節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)窮舉法需要計(jì)算316=43 046 721 個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，如果每個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)選取10 000 組隨機(jī)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，總計(jì)算量將達(dá)到千億量級(jí)，完成計(jì)算大概需要至少19 年時(shí)間。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)的微小增加對(duì)計(jì)算能力的挑戰(zhàn)是巨大的。因此，目前大多數(shù)的網(wǎng)絡(luò)窮舉方法只能用在節(jié)點(diǎn)數(shù)不超過3個(gè)的網(wǎng)絡(luò)中。

圖2 網(wǎng)絡(luò)窮舉研究適應(yīng)性功能的特定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的計(jì)算過程［36］Fig.2 Illustration of the calculation procedure for a given topology for adaptation[36]

圖3 能較好實(shí)現(xiàn)完美適應(yīng)的最小網(wǎng)絡(luò)［36］Fig.3 Minimal adaptive topologies[36]

但是復(fù)雜的功能通常伴隨著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，三節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并不能滿足我們對(duì)復(fù)雜功能網(wǎng)絡(luò)的研究需求。前人的大量研究表明，特定的調(diào)控模塊被廣泛使用在不同的生物系統(tǒng)中［43-45］，這啟發(fā)了我們可以從模塊化的角度來研究具有復(fù)雜功能的生物網(wǎng)絡(luò)。我們將網(wǎng)絡(luò)窮舉與模塊化的思路相結(jié)合，提出了子網(wǎng)絡(luò)合并的研究方法。這種方法削弱了網(wǎng)絡(luò)窮舉對(duì)研究網(wǎng)絡(luò)尺度的限制，拓展了網(wǎng)絡(luò)窮舉方法的研究范圍。該方法的核心思想是：先將復(fù)雜的目標(biāo)功能拆分成若干簡(jiǎn)單的子功能，然后利用三節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)窮舉的方法篩選出子網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)子網(wǎng)絡(luò)合并的方式將不同子網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)合并以形成大的組合網(wǎng)絡(luò)，最終從大的組合網(wǎng)絡(luò)中挑選出具有目標(biāo)功能且魯棒性高的網(wǎng)絡(luò)［46］。例如，在設(shè)計(jì)具有巴甫洛夫條件反射的復(fù)雜功能的網(wǎng)絡(luò)中，先將網(wǎng)絡(luò)的總功能劃分為記憶和響應(yīng)兩個(gè)子功能模塊，用蛋白質(zhì)相互作用和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個(gè)層面的網(wǎng)絡(luò)窮舉方法篩選出了合適的記憶網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，然后將子網(wǎng)絡(luò)合并后篩選得到最終具有目標(biāo)功能的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）［47］。為了保證節(jié)點(diǎn)合并的合理性，引入的節(jié)點(diǎn)合并的邏輯限制主要在于被合并在一起的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)接收的輸入信號(hào)間、調(diào)控關(guān)系間均不能相互矛盾，以及合并后的節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生的輸出信號(hào)間不能相互矛盾。節(jié)點(diǎn)合并時(shí)，分別從兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)庫中各取一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)合并的邏輯限制，分別以合并一個(gè)節(jié)點(diǎn)、兩個(gè)節(jié)點(diǎn)以及三個(gè)節(jié)點(diǎn)的順序模擬節(jié)點(diǎn)合并后的組合網(wǎng)絡(luò)的功能，篩選得到最終具有目標(biāo)功能的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中利用邏輯代數(shù)正向設(shè)計(jì)的巴甫洛夫條件反射調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相比，我們發(fā)現(xiàn)用子網(wǎng)絡(luò)合并法得到的組合網(wǎng)絡(luò)具有更高的魯棒性，其Q值可以提高1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)，這凸顯了逆向工程方法的優(yōu)越性。此外，我們還將子網(wǎng)絡(luò)合并的方法運(yùn)用到具有多功能信號(hào)編碼性質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)中，找到了能在不同的刺激條件下分別產(chǎn)生振蕩、適應(yīng)性和持續(xù)性激活三種功能的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終實(shí)現(xiàn)了多功能信號(hào)編碼的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［48］。這種子網(wǎng)絡(luò)合并的方法不僅擴(kuò)大了生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尺度（圖5），而且?guī)椭覀儚膹?fù)雜功能與簡(jiǎn)單模塊的角度加深了對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能的理解。

圖4 子網(wǎng)絡(luò)合并法得到的最優(yōu)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［47］Fig.4 Results of the robust sub-network combinations with high Q-value[47]

目前已經(jīng)有許多逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的研究工作，但大部分工作停留在理論計(jì)算層面，缺乏后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。合成生物學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的缺乏讓我們無法知道逆向工程可以對(duì)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的指導(dǎo)程度。這不僅阻礙了我們對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)運(yùn)行規(guī)律的進(jìn)一步學(xué)習(xí)和理解，而且限制了合成生物學(xué)的發(fā)展，不利于合成生物學(xué)解決能源、資源、環(huán)境、醫(yī)療健康等問題。所以，將逆向工程的理論與合成生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來顯得格外重要。我們首次將逆向工程的理性設(shè)計(jì)與合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，通過三節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)窮舉篩選出了具有超敏開關(guān)特性的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而利用合成生物學(xué)的手段實(shí)現(xiàn)了超敏細(xì)胞密度開關(guān)的理性設(shè)計(jì)，初步驗(yàn)證了逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的可行性（圖6）［49］。在研究中我們發(fā)現(xiàn)并非所有理論設(shè)計(jì)的網(wǎng)絡(luò)都能在實(shí)驗(yàn)中被成功構(gòu)建，所以需要依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)一步篩選網(wǎng)絡(luò)?？紤]到實(shí)驗(yàn)中需要使用的元件特性，我們提出了具體的實(shí)驗(yàn)可行性限制條件，即節(jié)點(diǎn)A、B對(duì)節(jié)點(diǎn)X（X=A，B，C）的調(diào)控關(guān)系必須一致（圖6）。我們將實(shí)驗(yàn)可行性限制條件引入到了網(wǎng)絡(luò)窮舉篩選網(wǎng)絡(luò)的過程中，挑選出了既具有理論指導(dǎo)意義又具有實(shí)驗(yàn)可行性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)庫，并從中選取了相互作用最簡(jiǎn)單且魯棒性最好的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。為了實(shí)現(xiàn)從逆向工程到正向工程的過渡，我們對(duì)最簡(jiǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了理論計(jì)算分析，找到了超敏性能與在實(shí)驗(yàn)上可以控制并調(diào)節(jié)的參數(shù)之間的約束關(guān)系，即節(jié)點(diǎn)A的自激活能力越強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)的整體超敏性能越好。進(jìn)而根據(jù)理論分析的結(jié)果選取了滿足參數(shù)理論要求的實(shí)驗(yàn)元件，精確組裝出了具有可預(yù)測(cè)能力的超敏細(xì)胞密度開關(guān)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中參數(shù)對(duì)功能的影響符合理論預(yù)測(cè)（圖7），實(shí)現(xiàn)了僅用單個(gè)元件獨(dú)自表征時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)就能預(yù)測(cè)元件組裝后的基因線路功能與性能的目標(biāo)［50］。在結(jié)合理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的過程中，引入實(shí)驗(yàn)可行性限制既在理論指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的層面上幫助實(shí)驗(yàn)從全局穩(wěn)定性角度得到了魯棒性最好的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，又在實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)理論的層面上幫助理論計(jì)算從實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)中抽象出了新的生物回路設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步說明了逆向工程與正向工程的結(jié)合讓系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)相互促進(jìn)、共同發(fā)展。

圖5 傳統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)窮舉與子網(wǎng)絡(luò)合并的計(jì)算復(fù)雜度對(duì)比［47］Fig.5 The complexity comparison between traditional enumeration and sub-networks combination[47]

圖6 網(wǎng)絡(luò)窮舉指導(dǎo)細(xì)胞密度超敏開關(guān)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的流程［49］Fig.6 The workflow of rational design guided by reverse engineering[49]

2.2 基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程

微分方程模型雖然能夠定量地描述網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)特征，但對(duì)計(jì)算能力的要求也很高。與連續(xù)模型的精細(xì)刻畫不同，離散模型雖然在很多情況下只能給出定性或半定量的結(jié)果，但是可以幫助我們研究更大尺度的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。布爾網(wǎng)絡(luò)是最簡(jiǎn)潔的離散邏輯模型。布爾網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)僅有“0”“1”兩種狀態(tài)，對(duì)應(yīng)分子表達(dá)的高低兩態(tài)，模型將節(jié)點(diǎn)間的調(diào)控關(guān)系簡(jiǎn)化成激活或抑制兩種狀態(tài)。N個(gè)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)在任一t時(shí)刻，所有節(jié)點(diǎn)狀態(tài)用長(zhǎng)度為N的向量S(t)表示，其中Si分量表示節(jié)點(diǎn)i的狀態(tài)，Si= 0（低態(tài)）和Si= 1（高態(tài)），節(jié)點(diǎn)間的相互作用由aij表示。節(jié)點(diǎn)狀態(tài)的變化由布爾方程Si(t+ 1)=Fi[S(t) ]確定，具體形式如式（3）。

圖7 參數(shù)的理論預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)測(cè)量［49］Fig.7 The comparison of prediction and measurements of parameters[49]

由于模型的簡(jiǎn)潔性，布爾網(wǎng)絡(luò)模型被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)傳導(dǎo)通路的全局動(dòng)力學(xué)特性研究，例如，研究者構(gòu)建了包含11個(gè)節(jié)點(diǎn)的芽殖酵母細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，用布爾方程的演化規(guī)則，遍歷計(jì)算211種初始狀態(tài)的演化，發(fā)現(xiàn)了所有的初始狀態(tài)均演化到7 個(gè)靜止?fàn)顟B(tài)（fixed point）中的某一個(gè)，其中約86%的初始狀態(tài)均演化到了G1期對(duì)應(yīng)的穩(wěn)態(tài)上，顯示了生物網(wǎng)絡(luò)的全局穩(wěn)定性。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)軌跡是一個(gè)一維中心流形，因而其生物學(xué)路徑也是全局穩(wěn)定的［51］。

基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程方法將網(wǎng)絡(luò)間的相互作用視作邏輯變量，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)路徑與布爾演化規(guī)則，推導(dǎo)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的反向公式，進(jìn)而獲得網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)信息。具體而言，t時(shí)刻的節(jié)點(diǎn)狀態(tài)作為輸入，t+1時(shí)刻的節(jié)點(diǎn)狀態(tài)作為輸出，節(jié)點(diǎn)i對(duì)節(jié)點(diǎn)j的調(diào)控用邏輯變量gij和rij表示： 節(jié)點(diǎn)i 抑制節(jié)點(diǎn)j 時(shí)rij = true， 否則rij= false；節(jié)點(diǎn)i激活節(jié)點(diǎn)j時(shí)gij= true，否則gij=false； 節(jié)點(diǎn)i與節(jié)點(diǎn)j無相互作用時(shí)gij= false，rij=false。由于節(jié)點(diǎn)i對(duì)節(jié)點(diǎn)j的調(diào)控是單一的，不會(huì)同時(shí)存在激活和抑制，故gij?rij= false。綜合節(jié)點(diǎn)變化的所有情況，我們有如式（4）。

所有節(jié)點(diǎn)在整個(gè)動(dòng)力學(xué)路徑演化下均滿足公式（4）。通過利用強(qiáng)抑制模型（rij= -∞）和具體的動(dòng)力學(xué)信息對(duì)公式（4）進(jìn)行求解，方程組的解可以轉(zhuǎn)化成析取范式形式（僅以邏輯“與”連接各項(xiàng)的形式），進(jìn)而得到調(diào)控關(guān)系［52-53］。

一般基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程方法需要從特定的動(dòng)力學(xué)軌跡出發(fā)。由于動(dòng)力學(xué)軌跡提供的網(wǎng)絡(luò)約束是有限的，當(dāng)我們通過目標(biāo)功能的一條動(dòng)力學(xué)軌跡進(jìn)行推導(dǎo)時(shí)，將會(huì)得到一個(gè)數(shù)量龐大的可能網(wǎng)絡(luò)庫。為了得到盡可能小的可能網(wǎng)絡(luò)庫，找到使可能網(wǎng)絡(luò)數(shù)量減少最快的實(shí)驗(yàn)路徑顯得格外重要。在確定的模型下，網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)軌跡由初態(tài)決定，因此選擇不同的初態(tài)對(duì)縮小網(wǎng)絡(luò)庫的范圍非常重要。我們根據(jù)網(wǎng)絡(luò)初態(tài)與動(dòng)力學(xué)軌跡的關(guān)系，提出了最大路徑距離、軌跡熵和隨機(jī)采樣三種選取網(wǎng)絡(luò)初態(tài)的方法，用于探索尋找最優(yōu)動(dòng)力學(xué)軌跡［54］。

最大路徑距離法的基本假設(shè)是：狀態(tài)i如果距離某條動(dòng)力學(xué)軌跡Ξ 越遠(yuǎn)，則i演化到該軌跡Ξ 的時(shí)間越久，演化過程中包含的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)信息就越多。定義狀態(tài)i到軌跡Ξ的距離Di如式（5）。式中，dij表示狀態(tài)i到Ξ中狀態(tài)j的距離，表征兩狀態(tài)間的相似性；是網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)k的狀態(tài)。被選取的初態(tài)i應(yīng)該滿足i= argmax(Di)。

軌跡熵法的基本思想是由初態(tài)確定的動(dòng)力學(xué)軌跡應(yīng)該在最大程度上降低網(wǎng)絡(luò)的不確定性。從狀態(tài)i出發(fā)共有k條不同的軌跡，其中有Nij個(gè)網(wǎng)絡(luò)可產(chǎn)生第j條軌跡Ξj，則網(wǎng)絡(luò)從狀態(tài)i經(jīng)過該軌跡Ξj的概率為

定義狀態(tài)i的軌跡熵如式（6）。

式中，軌跡熵Ei表示由狀態(tài)i出發(fā)演化的不確定性，不確定性越大，從該狀態(tài)出發(fā)所包含的信息越多。理論上應(yīng)該取軌跡熵最大的狀態(tài)作為初態(tài)，但由于可能網(wǎng)絡(luò)的數(shù)目龐大，很難用這種方法直接準(zhǔn)確計(jì)算軌跡熵。因此，通過引入轉(zhuǎn)移概率bij并假設(shè)其在演化中不變，得到狀態(tài)i在第n步軌跡熵的估算迭代公式如式（7）。

利用式（7）計(jì)算得到的收斂值即為從狀態(tài)i出發(fā)的軌跡熵Ei。

隨機(jī)采樣法的基本假設(shè)是，在可能網(wǎng)絡(luò)庫中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的網(wǎng)絡(luò)，如果該采樣網(wǎng)絡(luò)集的每條軌跡對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)分布與整體網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)分布相似，則該采樣網(wǎng)絡(luò)集的最大軌跡熵應(yīng)該與可能網(wǎng)絡(luò)庫的最大軌跡熵一致。因此，在可能網(wǎng)絡(luò)庫中不斷增加隨機(jī)抽取的網(wǎng)絡(luò)數(shù)量并計(jì)算該網(wǎng)絡(luò)集的軌跡熵，直到軌跡熵收斂為止。

通過提出最大路徑距離、軌跡熵和隨機(jī)采樣三種初態(tài)選取的方法，我們?cè)谌齻€(gè)已知生物調(diào)控系統(tǒng)（芽殖酵母細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)、裂殖酵母細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)和大腸桿菌SOS 通路）中模擬計(jì)算并比較了計(jì)算復(fù)雜度、剩余可能網(wǎng)絡(luò)數(shù)與試驗(yàn)步數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了隨機(jī)采樣法的綜合表現(xiàn)最好，最大路徑距離法最差（圖8）［54］。

對(duì)于可能網(wǎng)絡(luò)庫很大的這一問題，雖然隨機(jī)采樣的方法在一定程度上縮小了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淇臻g，但剩余網(wǎng)絡(luò)數(shù)量依舊龐大，需要進(jìn)一步尋找新的優(yōu)化策略。已有的研究表明最小網(wǎng)絡(luò)是具有特定生物功能且調(diào)控邊數(shù)最少的網(wǎng)絡(luò)，被認(rèn)為是行使生物功能的骨架網(wǎng)絡(luò)［52］。這啟發(fā)我們利用最小網(wǎng)絡(luò)約束這一條件來進(jìn)一步減少可能網(wǎng)絡(luò)的數(shù)量。最小網(wǎng)絡(luò)約束的思路是：在隨機(jī)采樣的基礎(chǔ)上，先根據(jù)目標(biāo)功能得到每個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的析取范式形式來確定網(wǎng)絡(luò)中一定存在的調(diào)控邊，然后對(duì)余下所有可能的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行窮舉計(jì)算得到最小網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［55］。例如，在設(shè)計(jì)具有裂殖酵母細(xì)胞周期功能的網(wǎng)絡(luò)研究中，由動(dòng)力學(xué)軌跡（表1）可得到節(jié)點(diǎn)Cdc2*有邏輯表達(dá)式如式（8）。

圖8 最大路徑距離、軌跡熵和隨機(jī)采樣三種方法在三種生物網(wǎng)絡(luò)中的表現(xiàn)［54］Fig.8 The performances of the three methods in different biological pathways[54]

根據(jù)式（8），可以確定具有目標(biāo)功能的所有網(wǎng)絡(luò)一定包含節(jié)點(diǎn)Slp1 對(duì)節(jié)點(diǎn)Cdc2*的抑制調(diào)控（RSlp1-Cdc2*= 1)。表達(dá)式（8）的不確定項(xiàng)一共產(chǎn)生了908個(gè)可能網(wǎng)絡(luò)，通過對(duì)這908個(gè)網(wǎng)絡(luò)窮舉計(jì)算，我們得到唯一最小網(wǎng)絡(luò)，即RSlp1-Cdc2*= 1，GCdc25-Cdc2*=1，其中節(jié)點(diǎn)Cdc25對(duì)節(jié)點(diǎn)Cdc2*的激活調(diào)控是由最小網(wǎng)絡(luò)約束得到的。在隨機(jī)采樣的基礎(chǔ)上，我們用最小網(wǎng)絡(luò)約束的逆向工程方法，通過對(duì)具有芽殖酵母細(xì)胞周期功能、大腸桿菌SOS功能和裂殖酵母細(xì)胞周期功能的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模擬計(jì)算，在有限次計(jì)算步驟內(nèi)篩選到了魯棒性高且功能穩(wěn)定的適量網(wǎng)絡(luò)（圖9）［55］。其中，在對(duì)具有芽殖酵母細(xì)胞周期功能的網(wǎng)絡(luò)計(jì)算時(shí)，含有最小網(wǎng)絡(luò)約束的逆向工程方法雖然在第一步計(jì)算后得到10 884個(gè)最小網(wǎng)絡(luò)和10條最小網(wǎng)絡(luò)公共邊，但在第九步計(jì)算后就只剩下了一個(gè)最小網(wǎng)絡(luò)［圖9（a）］，且該最小網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于真實(shí)的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，證實(shí)了最小網(wǎng)絡(luò)限制條件的合理性與有效性，進(jìn)一步優(yōu)化了逆向工程的過程。上述隨機(jī)采樣法和最小網(wǎng)絡(luò)約束的兩個(gè)理論研究是基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的雛形。

表1 裂殖酵母細(xì)胞周期功能的動(dòng)力學(xué)軌跡［55］Tab.1 Biological pathway of fission yeast cell cycle network［55］

在以上基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程方法的設(shè)計(jì)中，我們并沒有考慮網(wǎng)絡(luò)的魯棒性。因而在功能網(wǎng)絡(luò)庫中會(huì)存在大量魯棒性不高的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。為了提高網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)的成功率，我們需要在基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程設(shè)計(jì)中加入生物網(wǎng)絡(luò)魯棒性的限制條件來篩選具有高魯棒性的設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)。非線性動(dòng)力學(xué)認(rèn)為系統(tǒng)的魯棒性是功能在系統(tǒng)狀態(tài)受外部擾動(dòng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和功能在系統(tǒng)參數(shù)受擾動(dòng)時(shí)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。目前常見的生物網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性限制包括衡量生物網(wǎng)絡(luò)全局狀態(tài)穩(wěn)定性的吸引盆大小和表征網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)演化軌跡全局吸引性的一維中心流形。除了上述兩種生物網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的限制條件外，我們又提出了網(wǎng)絡(luò)調(diào)控熵的概念，從網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的角度對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)魯棒性提出了新的限制。普遍認(rèn)為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)行為主要由拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的性質(zhì)決定。因此，生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的魯棒性應(yīng)該源于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中調(diào)控邊的特殊分配。我們從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征出發(fā)，提出了衡量網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與魯棒性關(guān)系的調(diào)控熵［56］。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基于圖論的命名，由若干節(jié)點(diǎn)和連接這些節(jié)點(diǎn)的所有通路構(gòu)成。通過定義路徑為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中從節(jié)點(diǎn)i出發(fā)到節(jié)點(diǎn)j的任意有向通路，我們得到了從節(jié)點(diǎn)i指向節(jié)點(diǎn)j的所有路徑集合p(i→j)。定義節(jié)點(diǎn)i對(duì)節(jié)點(diǎn)j的調(diào)控熵Sij如式（9）。

式中，pij是p(i→j)中從節(jié)點(diǎn)i指向節(jié)點(diǎn)j的激活路徑數(shù)占總路徑數(shù)的比例。當(dāng)p(i→j)中沒有激活路徑或均為激活路徑時(shí)，pij趨向于0或1，對(duì)應(yīng)的調(diào)控熵Sij取最小值0，當(dāng)pij=1/2 時(shí)，調(diào)控熵Sij取最大值1。通過進(jìn)一步定義節(jié)點(diǎn)的調(diào)控熵Sj為所有指向節(jié)點(diǎn)j的調(diào)控熵Sij的均值，那么網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵S是網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的調(diào)控熵Sj的均值。例如，在圖10所示的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，各節(jié)點(diǎn)的調(diào)控熵與該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵S如式（10）～式（13）。

圖9 隨機(jī)采樣法和最小網(wǎng)絡(luò)約束在不同網(wǎng)絡(luò)中的表現(xiàn)［55］Fig.9 The performances of the two methods in different biological pathways[55]

調(diào)控熵作為序參量，用于描述網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系整體耦合的非一致性。顯然，網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控關(guān)系越一致，網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵越小。

通過對(duì)具有芽殖酵母細(xì)胞周期和裂殖酵母細(xì)胞周期功能的生物網(wǎng)絡(luò)與相同調(diào)控邊的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的研究，我們發(fā)現(xiàn)了生物網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵遠(yuǎn)低于絕大部分隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵。此外，通過對(duì)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究，我們發(fā)現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵越低，對(duì)應(yīng)的吸引盆越大（圖11），且Q值越高（圖12），即網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵越低魯棒性越高。為了驗(yàn)證該理論的普遍性，在四個(gè)網(wǎng)絡(luò)尺度更大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的計(jì)算結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了調(diào)控熵與魯棒性的負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過引入調(diào)控熵這一序參量，建立了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與魯棒性之間的聯(lián)系，即網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控關(guān)系越一致，調(diào)控熵越低，對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)魯棒性越高。因此，在具有復(fù)雜功能的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中，調(diào)控熵的引入將極大地提高調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的魯棒性，進(jìn)一步降低復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)的難度。

圖10 網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控熵的計(jì)算示例［56］Fig.10 Illustration of calculating the regulation entropy[56]

圖11 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控熵與動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)系［56］Fig.11 The relationship of network regulation entropy anddynamic stability[56]

圖12 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控熵與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)系［56］Fig.12 The relationship of network regulation entropy and structural stability[56]

基于上述工作，通過分析系統(tǒng)生物學(xué)已有的研究方法，我們又提出了結(jié)合布爾網(wǎng)絡(luò)與連續(xù)模型各自優(yōu)勢(shì)的指導(dǎo)理性設(shè)計(jì)的新思路（圖13）［57］：首先，在最小網(wǎng)絡(luò)約束的限制下用基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程方法篩選出具有目標(biāo)功能的可能網(wǎng)絡(luò)庫，然后利用連續(xù)模型對(duì)其中的每個(gè)可能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)研究與性能評(píng)價(jià)（圖14）［58］。例如，在對(duì)具有SOS 響應(yīng)功能的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)探索中，首先在隨機(jī)采樣和最小網(wǎng)絡(luò)約束的基礎(chǔ)上，用基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程方法得到了48 個(gè)最小網(wǎng)絡(luò)與7.1× 106個(gè)可能的網(wǎng)絡(luò)，再用微分方程模型對(duì)所有備選網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。與網(wǎng)絡(luò)窮舉類似，對(duì)每個(gè)備選網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算時(shí)，用Q值和吸引盆大小這兩個(gè)指標(biāo)來定量刻畫網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的魯棒性。從離散模型過渡到連續(xù)模型時(shí)，布爾網(wǎng)絡(luò)的粗?；瘯?huì)使時(shí)間尺度與離散閾值的選取不唯一，進(jìn)而導(dǎo)致離散模型下的一條軌跡對(duì)應(yīng)連續(xù)模型下的不同時(shí)序軌跡。為了解決這個(gè)問題，我們提出了在離散模型和連續(xù)模型下的具體限制條件（圖15）。通過連續(xù)模型對(duì)所有最小網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)刻畫，發(fā)現(xiàn)了由離散模型篩選的最小網(wǎng)絡(luò)均能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)功能且普遍具有較高魯棒性，說明第一步的離散模型幫助我們剔除了大量無關(guān)網(wǎng)絡(luò)，減小了連續(xù)模型的計(jì)算量，避免了計(jì)算的浪費(fèi)。此外，對(duì)芽殖酵母細(xì)胞周期功能的研究結(jié)果也證明了我們這種方法指導(dǎo)理性設(shè)計(jì)的合理性與有效性。這種從離散模型到連續(xù)模型的方法不僅可以找到具有特定功能且魯棒性高的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還可以幫助我們理解生物網(wǎng)絡(luò)的功能設(shè)計(jì)原理。

圖13 從布爾網(wǎng)絡(luò)模型到連續(xù)模型的生物回路設(shè)計(jì)流程圖［57］Fig.13 The workflow of the design from Boolean network model to continuous model[57]

圖14 連續(xù)模型的定量刻畫與評(píng)價(jià)流程［58］Fig 14 The workflow of continuous model[58]

圖15 在布爾網(wǎng)絡(luò)模型和連續(xù)模型下的三個(gè)限制條件［58］Fig.15 The three criteria in the Boolean network model andcontinuous model[58]

3 總 結(jié)

合成生物學(xué)在自下而上的正向工程指導(dǎo)下取得了一定的成功，然而，通過這種思路得到的設(shè)計(jì)原理是單一的、沒有系統(tǒng)性的，而且這種設(shè)計(jì)思路忽視的問題在復(fù)雜系統(tǒng)的理性設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)中變成了主要問題。在系統(tǒng)生物學(xué)的幫助下，逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的方法，既能獲得具有復(fù)雜功能的生物網(wǎng)絡(luò)，又能降低回路設(shè)計(jì)的難度。目前關(guān)于逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)的工作，如網(wǎng)絡(luò)窮舉、子網(wǎng)絡(luò)合并、基于布爾網(wǎng)絡(luò)的逆向工程、從離散模型到連續(xù)模型的方法等，均表明這種方法的可行性與有效性，為后續(xù)的研究提供了有價(jià)值的信息。但是，目前用逆向工程指導(dǎo)合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究工作依舊太少，兩者的結(jié)合程度還達(dá)不到實(shí)際的要求程度，需要更多的實(shí)驗(yàn)實(shí)例驗(yàn)證。造成這一現(xiàn)象的主要原因是精準(zhǔn)組裝具有復(fù)雜調(diào)控功能的基因線路的困難。精準(zhǔn)組裝指的是用元件獨(dú)自表征時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)就足夠預(yù)測(cè)元件組裝后的基因線路功能與性能。目前精準(zhǔn)組裝調(diào)控線路是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的工作，即使構(gòu)建簡(jiǎn)單的基因線路也需要耗費(fèi)大量的時(shí)間。而基因線路精準(zhǔn)組裝的困難主要來自于：生物系統(tǒng)的元器件存在突變、進(jìn)化等各種遺傳穩(wěn)定性問題、生物元器件組裝后在宿主細(xì)胞中的相互作用對(duì)目標(biāo)功能的影響、構(gòu)建的外源復(fù)雜基因回路與宿主細(xì)胞的相互影響等問題［59］。雖然在精準(zhǔn)組裝方面已有初步研究進(jìn)展［49，59-60］，但是目前精準(zhǔn)組裝基因線路的難度依舊很大，有待我們進(jìn)一步研究，從而更加方便地構(gòu)建具有復(fù)雜功能的調(diào)控回路。我們相信，在突破逆向工程在合成生物學(xué)中實(shí)際應(yīng)用的瓶頸后，在逆向工程的指導(dǎo)下，合成生物學(xué)的理性設(shè)計(jì)很快可以投入到具體的應(yīng)用生產(chǎn)中。