高效液相色譜法測(cè)定止喘靈注射液中鹽酸麻黃堿、丁溴東莨菪堿和苦杏仁苷含量

崔雅慧，金志國(guó)

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

目前，止喘靈注射液在我國(guó)臨床應(yīng)用廣泛，加強(qiáng)對(duì)其質(zhì)量控制對(duì)于保障患者的用藥安全，具有重要意義[1]。止喘靈注射液是由麻黃、洋金花、苦杏仁和連翹4 味藥材經(jīng)煎煮、過濾、濃縮、沉淀、殺菌等工藝加工而成的中藥注射劑[2]，具有宣肺平喘、祛痰止咳的功效，臨床常用于治療痰濁阻肺、肺失宣降所致的哮喘、咳嗽、胸悶、痰多等癥，對(duì)支氣管哮喘、喘息性支氣管炎效果明顯[3－4]。方中麻黃有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫等功效[5－8]，洋金花有平喘止咳、解痙定痛等功效[9－13]，苦杏仁有降氣止咳平喘、潤(rùn)腸通便等功效[14－17]。2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》中，止喘靈注射液含量測(cè)定項(xiàng)不能更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。該藥方中麻黃為君藥，洋金花為臣藥，苦杏仁為佐藥，連翹為使藥，麻黃、洋金花和苦杏仁3 味藥材成分最大，吸收波長(zhǎng)接近。因此，本研究中建立了測(cè)定止喘靈注射液中鹽酸麻黃堿、東莨菪堿和苦杏仁苷含量的高效液相色譜(HPLC)法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu Prominence LC －20A 型高效液相色譜儀，包括SPD－M20A 型PDA 檢測(cè)器、SIL －20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO －20A 型自動(dòng)柱溫箱、LC－Solution 型色譜工作站（日本島津公司）；Quintix65 －1CN 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Waters Sunfire C18色譜柱（美國(guó)沃特世公司）；FRQ－1006T 型超聲波儀（杭州法蘭特科技公司，功率為300 W，頻率為42 kHz）；Milli－Q advantage A10 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

止喘靈注射液（江蘇蘇中藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為19030212，19040415，19050311，規(guī)格為每支2 mL）；鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171241 －201809，含量以100.0% 計(jì)），丁溴東莨菪堿對(duì)照品（批號(hào)為100130 －201103，含量以99.7% 計(jì)），苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)為110820 －201808，含量以88.2%計(jì)），均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（Tedia 試劑公司）；磷酸、三乙胺、十二烷基苯磺酸鈉均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)）；試驗(yàn)用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL ／min；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B，含0.05%三乙胺和0.02%十二烷基苯磺酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH 至6.0），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)? ～7 min時(shí)3%A，7 ～26 min 時(shí)3%A ～58%A，26 ～29 min 時(shí)58%A ～3%A，29 ～34 min 時(shí)3%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品25.00 mg、丁溴東莨菪堿對(duì)照品25.07 mg、苦杏仁苷對(duì)照品28.34 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合貯備溶液，精密移取該貯備溶液1.0 mL，置50 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品(批號(hào)為19030212)，精密量取1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和制備工藝制備缺麻黃、洋金花和苦杏仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取試劑空白溶液及2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。色譜圖見圖1?？梢姡幮詫?duì)照品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密移取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品混合貯備溶液，加流動(dòng)相制成含鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷和丁溴東莨菪堿質(zhì)量濃度依次為0.3，0.6，1.0，3.0，6.0，10.0 μg ／mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按擬訂色譜條件依次進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果3 種成分質(zhì)量濃度均在0.3 ～10.0 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。詳見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果( n ＝6)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為19030212），依法制備供試品溶液，室溫下放置0，3，6，9，12，18，24 h 時(shí)分別取樣，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果鹽酸麻黃堿、丁溴東莨菪堿和苦杏仁苷峰面積的RSD 分別為2.34%，1.91%，1.47%( n ＝7)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為19030212），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果鹽酸麻黃堿、丁溴東莨菪堿和苦杏仁苷含量的 RSD 分別為2.92%，3.56%，4.09% ( n ＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果鹽酸麻黃堿、丁溴東莨菪堿和苦杏仁苷峰面積的 RSD 分別為1.58%，2.02%，1.43% ( n ＝6)，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為19030212），精密量取1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，共6 份，分別加入2.2 項(xiàng)下對(duì)照品混合貯備溶液適量，依法制備供試品溶液。按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品( 批號(hào)分別為19030212，19040415，19050311)，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

圖1 高效液相色譜圖

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

表3 3 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg ／L）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別取鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷和丁溴東莨菪堿對(duì)照品，加流動(dòng)相制備溶液，在紫外可見區(qū)進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷和丁溴東莨菪堿分別在210，208，214 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，3 種待測(cè)成分最大吸收波長(zhǎng)相近。結(jié)合紫外響應(yīng)值大小，最終確定210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果表明，選擇210 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，3 種成分響應(yīng)較好，峰形尖銳，且陰性無干擾。

3.2 流動(dòng)相選擇

由于鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷和丁溴東莨菪堿3 種成分檢測(cè)波長(zhǎng)均在210 nm 附近，考慮到甲醇截止波長(zhǎng)在210 nm，為降低溶劑基質(zhì)干擾，故選擇乙腈體系。本研究中考察了乙腈－水、乙腈－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液（含0.05%三乙胺和0.02%十二烷基苯磺酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH 至6.0）作為流動(dòng)相體系時(shí)，對(duì)3 種成分分離、定量效果的影響，結(jié)果選擇乙腈－水、乙腈－0.1% 磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，鹽酸麻黃堿和丁溴東莨菪堿保留時(shí)間短，過早地出峰導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確；選擇乙腈－0.1% 磷酸溶液（含0.05% 三乙胺和0.02% 十二烷基苯磺酸鈉，磷酸調(diào)節(jié)pH 至6.0）體系時(shí)，3 種成分峰形尖銳，分離度均大于1.5，且定量結(jié)果準(zhǔn)確，故最終選擇第3 種乙腈體系作為流動(dòng)相體系。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中所建立的方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于止喘靈注射液中鹽酸麻黃堿、東莨菪堿和苦杏仁苷成分的含量測(cè)定。