高效液相色譜法測定壯骨止痛口服膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量

熊有明，崔 虹，曾 珍

（1. 重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000； 2. 重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院，重慶 404000）

壯骨止痛口服膏為重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由黃芪、當(dāng)歸、續(xù)斷、熟地黃、補(bǔ)骨脂等12 味中藥組方。臨床應(yīng)用證實，其具有益氣血、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨的功效，主要用于筋骨折傷后期、腰膝酸痛、筋骨痿軟等癥。方中續(xù)斷為君藥，性微溫，味苦、辛，補(bǔ)肝腎，可強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷等。皂苷類為續(xù)斷的主要有效成分，其中以川續(xù)斷皂苷Ⅵ為代表，2015 年版《中國藥典（一部）》[1]將川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為續(xù)斷藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有鑒別和通則檢查，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證用藥安全，本研究中探討了壯骨止痛口服膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測定方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供了定量檢測方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC －20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Mettler－XP204 型天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為萬分之一）；Sartorius－ME215S 型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111685 －201707，含量為90.9%）；壯骨止痛口服膏（重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院，批號分別為20190903，20190918，20191010）；正丁醇、甲醇均為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（28 ∶72，V／ V）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：212 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品23.30mg，精密稱定，置20mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液適量，以甲醇稀釋成含川續(xù)斷皂苷Ⅵ分別為0.021 2，0.105 9，0.211 8，0.311 7，0.529 5 mg ／mL 的系列對照品溶液。取本品2.5 g，精密稱定，置250 mL 分液漏斗中，加20 mL 水溶解，用水飽和正丁醇提取5 次，每次30 mL，合并正丁醇，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方（不含續(xù)斷）及本品工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取對照品溶液( 質(zhì)量濃度為0.211 8 mg／mL)、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1?？梢姡幮詫φ諢o干擾，方法專屬性良好，且川續(xù)斷皂苷Ⅵ和其他組分可達(dá)到基線分離。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：按擬訂色譜條件，將2.2 項下川續(xù)斷皂苷Ⅵ系列對照品溶液各10 μL 注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝2.112 7 ×106X ＋261.55，r ＝0.999 9。結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量在0.212 ～5.295 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取質(zhì)量濃度為0.211 8 mg ／mL的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果峰面積均值為447 728，RSD 為0.89%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20190903）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果峰面積均值為370 518，RSD 為0.28%（n ＝7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20190903）樣品，依法制備供試品6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計算含量。結(jié)果平均含量為0.771 mg／g，RSD 為0.86%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品9 份，每份約1 g，精密稱定，置250 mL 分液漏斗中，精密加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品貯備液0.4，0.8，1.6 mL，每個濃度平行3份，依法進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取3 批供試品(批號分別為20190903，20190918，20191010)，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果3 批樣品平均含量分別為0.771，0.750，0.782 mg ／g。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

壯骨止痛口服膏處方由續(xù)斷、黃芪、黨參、枸杞、杜仲、當(dāng)歸等12 種中藥組方，加上輔料，成分復(fù)雜，干擾嚴(yán)重。曾考察氯仿、乙醚、水飽和正丁醇對提取效果的影響，結(jié)果表明，水飽和正丁醇提取較完全，并可減少輔料及其他中藥組分的干擾，故最終選擇用水飽和正丁醇作為提取溶劑。

表1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）

3.2 波長選擇

參考2015 年版《中國藥典（一部）》[1]及文獻(xiàn)[2－4]中的方法，曾同時通過在200 ～400 nm 波長范圍內(nèi)的全波段掃描，確定川續(xù)斷皂苷Ⅵ最大吸收在212 nm 波長附近，最終確定測定波長為212 nm。

3.3 流動相選擇

參照2015 年版《中國藥典（一部）》[1]中續(xù)斷藥材含量測定項下的流動相，曾考察乙腈與水的比例，根據(jù)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的峰形、理論板數(shù)與分離度，確定乙腈－水(28 ∶72，V／ V)為流動相時分離效果較理想。

3.4 方法評價

采用HPLC 法測定壯骨止痛口服膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，受主客觀因素的干擾較小，且準(zhǔn)確、簡便，重復(fù)性好，可作為壯骨止痛口服膏的定量分析方法。