不同產(chǎn)地五靈脂質(zhì)量研究

李筱婧，汪 晶，2，江阿古麗·艾山，韋英杰，2，許 歡，黃一平，2，江 安，陳 斌，2

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院·附屬省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028； 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院·國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210028； 3. 新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院，新疆 伊犁 835000）

五靈脂F(xiàn)aecestrogopterori 為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥糞便，又名藥本、寒號(hào)蟲(chóng)糞、靈脂等，主產(chǎn)于河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古、吉林、新疆等地。其全年均可采收，除去雜質(zhì)，曬干，味咸、甘，性溫，歸肝經(jīng)，具有活血、化瘀、止痛功效，主治胸脅或脘腹刺痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、產(chǎn)后血瘀疼痛、跌撲腫痛、蛇蟲(chóng)咬傷[1－8]。其主要化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、苷類(lèi)、有機(jī)酸等[9]，其中最主要的雙黃酮類(lèi)成分是穗花杉雙黃酮（amentoflavone）。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)穗花杉雙黃酮的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗微生物、降血糖、擴(kuò)張血管等多種藥理作用均有研究[10－13]。由于穗花杉雙黃酮的顯著藥理活性與五靈脂的中醫(yī)臨床功效相符，故國(guó)內(nèi)外正開(kāi)展一系列新藥開(kāi)發(fā)研究。但1990 年版《中國(guó)藥典(一部)》僅收載了五靈脂的性狀、炮制、性味、功能、主治等項(xiàng)目，2015 年版《陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》中收載了其薄層鑒別法，目前并未制訂五靈脂藥材的含量限度，相關(guān)法定藥材標(biāo)準(zhǔn)仍不完善。本研究中對(duì)不同產(chǎn)地五靈脂的水分及浸出物含量、穗花杉雙黃酮進(jìn)行薄層鑒別和含量測(cè)定[14－15]進(jìn)行了研究，為五靈脂藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD 檢測(cè)器和色譜工作站，美國(guó)Agilent 公司）；MT5 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為百萬(wàn)分之一）；ZF－90D 型暗箱式紫外分析儀（上海廣豪分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

穗花杉雙黃酮對(duì)照品（批號(hào)為111902 －201603，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇、磷酸均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水；五靈脂樣品經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院黃一平研究員鑒定為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥糞便，其他信息詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

根據(jù)外形不同，五靈脂分為靈脂米和靈脂塊，常用產(chǎn)地中大部分為靈脂米，新疆產(chǎn)五靈脂多為靈脂塊，詳見(jiàn)圖1。靈脂米為長(zhǎng)橢圓形顆粒，長(zhǎng)0.5 ～1.5 cm，直徑3 ～5 mm，表面顏色為黃棕色至黑棕色不等，表面微粗糙，可見(jiàn)淡黃色的纖維，有的略平滑具光澤；質(zhì)輕，易折斷，斷面黃綠色或棕褐色，纖維性；氣微，詳見(jiàn)樣品1 ～9，11 ～12。靈脂塊為不規(guī)則的塊狀，大小不一，表面黑棕色，凹凸不平，斷面黃棕色或棕褐色，間或有黃棕色樹(shù)脂狀物質(zhì)，質(zhì)硬，氣腥臭，詳見(jiàn)樣品10。

表1 不同產(chǎn)地五靈脂藥材水分、浸出物含量測(cè)定結(jié)果（± s，%，n ＝3）

表1 不同產(chǎn)地五靈脂藥材水分、浸出物含量測(cè)定結(jié)果（± s，%，n ＝3）

編號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12產(chǎn)地內(nèi)蒙古吉林湖北廣東廣東山西山西陜西陜西新疆河北河北批號(hào)190102341 20190313 150524 20190515 20190585 20190313 20190301 1903001 1903021 180501 180508 190301水分6.63 ±0.21 8.55 ±0.16 6.63 ±0.23 6.85 ±0.20 7.26 ±0.09 7.52 ±0.13 5.36 ±0.05 5.99 ±0.03 7.20 ±0.13 10.83 ±0.13 5.11 ±0.17 5.66 ±0.32浸出物9.26 ±0.15 10.01 ±0.11 11.20 ±0.12 9.97 ±0.05 8.94 ±0.09 9.73 ±0.08 9.54 ±0.10 10.23 ±0.22 11.07 ±0.23 8.13 ±0.09 10.61 ±0.18 10.53 ±0.25

圖1 五靈脂藥材樣品性狀

2.2 水分測(cè)定

參照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832 水分測(cè)定法中第二法（烘干法）[15]，對(duì)12 批樣品進(jìn)行水分測(cè)定。取樣品粉末約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，精密稱(chēng)定，開(kāi)啟瓶蓋在100 ～105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱(chēng)定質(zhì)量，100 ～105 ℃干燥1 h，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，至連續(xù)2 次稱(chēng)定質(zhì)量的差異不超過(guò)5 mg 為止，根據(jù)減失的質(zhì)量，計(jì)算藥材中含水量（%）。結(jié)果藥材含水量為5.11 % ～10.83 %，詳見(jiàn)表1。

2.3 浸出物測(cè)定

參照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2201 浸出物測(cè)定法[15]。以20%乙醇為溶劑，對(duì)12 批樣品的浸出物含量進(jìn)行測(cè)定。取樣品粉末，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加20%乙醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，靜置1 h，加熱回流1 h，放冷后，再稱(chēng)定質(zhì)量，用20%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，量取濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，稱(chēng)定質(zhì)量。結(jié)果醇溶性浸出物含量為8.13 % ～11.20%，詳見(jiàn)表1。

2.4 薄層色譜鑒別

取藥材粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，加50 mL 90%甲醇，加熱回流30 min，放冷，靜置，取上清液濾過(guò)，取濾液25 mL，蒸干，加2 mL 甲醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?。另取穗花杉雙黃酮對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 穗花杉雙黃酮的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液3 μL，對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以異丙醇－濃氨－水（13 ∶1 ∶1，V／ V／ V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 五靈脂薄層色譜圖

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：X－Bridge C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸（60∶40，V／ V）；流速：1.0mL／min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按穗花杉雙黃酮峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.5.2 溶液制備

取穗花杉雙黃酮對(duì)照品2 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成每1 mL 含穗花杉雙黃酮202.6 μg 的溶液，即得對(duì)照品溶液。取五靈脂藥材粉末1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖3。在該色譜條件下，該成分達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)大于3 000；供試品溶液色譜峰紫外吸收光譜與對(duì)照品溶液完全一致，表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

線(xiàn)性關(guān)系考察：取2.5.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，配制成質(zhì)量濃度為2.026，4.052，8.104，10.130，16.208 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y＝40.145X－5.513 3，R ＝0.999 9。結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度在2.026 ～16.208 μg ／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取適量同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果穗花杉雙黃酮峰面積的RSD 為0.31%( n ＝6)，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取12 號(hào)產(chǎn)地為河北的五靈脂藥材粉末6 份，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果穗花杉雙黃酮含量的RSD 為0.65%( n ＝6)，表明方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取適量樣品（批號(hào)為190301），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果穗花杉雙黃酮含量的RSD 為0.70%( n ＝6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的藥材粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入適量穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.4 樣品含量測(cè)定

取12 批樣品粉末各1 g，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 高效液相色譜圖及紫外吸收光譜圖

表2 穗花杉雙黃酮加樣回收試驗(yàn)（n ＝6）

表3 不同產(chǎn)地五靈脂藥材穗花杉雙黃酮含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

本研究中樣品來(lái)自各地方藥店及中藥飲片廠(chǎng)，可較真實(shí)全面地反映臨床實(shí)際應(yīng)用中五靈脂的質(zhì)量。12 批五靈脂中2 批產(chǎn)自廣東，2 批產(chǎn)自山西，2 批產(chǎn)自陜西，2批產(chǎn)自河北，其余分別產(chǎn)自?xún)?nèi)蒙古、吉林、湖北、新疆，合計(jì)8 個(gè)產(chǎn)地，包括靈脂米與靈脂塊2 種類(lèi)別。中藥材中含水量超出一定范圍就會(huì)直接影響藥材的質(zhì)量，易出現(xiàn)蟲(chóng)害、霉變、潮解等變質(zhì)現(xiàn)象；浸出物含量是反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，確保其療效確切、質(zhì)量可靠的重要指標(biāo)，故本研究中對(duì)不同產(chǎn)地五靈脂藥材的水分及浸出物含量進(jìn)行了測(cè)定。

本研究中對(duì)五靈脂中穗花杉雙黃酮的薄層色譜鑒別進(jìn)行了改進(jìn)，多數(shù)文獻(xiàn)中對(duì)五靈脂中穗花杉雙黃酮的薄層鑒別均使用聚酰胺薄膜及二氯甲烷－甲醇展開(kāi)劑系統(tǒng)，聚酰胺薄膜不易操作，斑點(diǎn)拖尾，展開(kāi)效果較差，重復(fù)性不好。本研究中考察了硅膠G、硅膠GF、聚酰胺薄膜等，確定了硅膠G 板為首選；考察了二氯甲烷－甲醇、乙醇－水、正丁醇－醋酸－水系統(tǒng)及異丙醇－濃氨－水展開(kāi)系統(tǒng)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，異丙醇－濃氨－水展開(kāi)系統(tǒng)的展開(kāi)效果較好。該方法操作簡(jiǎn)便，斑點(diǎn)清晰，且高效、快速、簡(jiǎn)便，較其他方法更合理。

本研究中考察了冷浸、超聲及回流的提取方式，以及不同的提取溶劑（乙醇、甲醇、90% 甲醇和80% 甲醇），不同提取時(shí)間及提取次數(shù)，最終確定了90%甲醇加熱回流30 min 為最佳提取方法。分別考察了不同流速（0.8，1.0，1.2 mL ／min）及不同柱溫（20，25，30 ℃），結(jié)果在上述色譜條件下，供試品溶液與對(duì)照品溶液相同時(shí)間出峰一致，綜合分離度及峰形等因素最終選定流動(dòng)相為甲醇－0.1% 磷酸（60 ∶40， V／ V），流速為1.0 mL／min，柱溫為25 ℃。此外，在測(cè)定穗花杉雙黃酮對(duì)照品的紫外吸收光譜圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，在330 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故以此為檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過(guò)對(duì)12 批樣品薄層鑒別及含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，除產(chǎn)地為新疆的五靈脂塊外，其他批次藥材均含有穗花杉雙黃酮，含量在0.035% ～0.050%?？紤]靈脂塊是復(fù)齒鼯鼠糞便與尿液的混合物夾以少量砂石干燥凝結(jié)而成，成分較靈脂米有差異，有待深入研究。市售臨床常用五靈脂飲片均為靈脂米，故穗花杉雙黃酮的測(cè)定有利于五靈脂藥材的質(zhì)量控制，可為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。