HPLC法同時測定三黃滴丸中5種蒽醌類成分的含量

魏艷婷，張靜宜，張華潭，李春花（1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050017；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，石家莊 050091）

三黃滴丸由大黃、黃芩浸膏、鹽酸小檗堿組成，是按照臨床常用的非處方藥三黃片組方比例進(jìn)行投料，運用固體分散技術(shù)制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、瀉火通便的功效。三黃滴丸較傳統(tǒng)片劑具有溶散速度快、藥物顆粒小、生物利用度高等優(yōu)點。對于這一新型制劑，目前生產(chǎn)工藝、含量測定等的研究均較少，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)暫不統(tǒng)一。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，同時測定了該復(fù)方制劑中5 種蒽醌類成分的含量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，在2010 年版《中國藥典》（一部）三黃片[1]的基礎(chǔ)上提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)報道如下。

1 材料

LC-15C 型HPLC 儀，包括SPD-15C 紫外檢測器、LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；1810-BC型石英自動雙重高純水蒸餾器（江蘇金壇市白塔石英玻璃儀器廠）；TG328B型分析天平（上海精科分析儀器廠）；KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）。

三黃滴丸（河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制，批號：20130315-01、20130315-02、20130315-03）。蘆薈大黃素對照品（批號：20120412，純度≥98%）、大黃酸對照品（批號：MUST-11032801，純度≥98%）、大黃素對照品（批號：MUST-12022715，純度≥98%）、大黃酚對照品（批號：20120320，純度≥98%）、大黃素甲醚對照品（批號：PF0223 SA13，純度≥98%）均由上海源葉生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水（河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制）。

2 方法與結(jié)果[2-6]

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.23%磷酸溶液（85∶15，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：440 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，分別置于10 ml量瓶中，加適量甲醇，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz）處理20 min，使溶解，加甲醇定容，即得對照品貯備液。取對照品貯備液各5 ml，置于同一25 ml量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為0.035、0.323、0.065、0.075、0.037 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三黃滴丸1.0 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz）處理20 min，加甲醇定容，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例和三黃滴丸的制備工藝制備缺大黃藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，供試品溶液與混合對照品溶液均在相同保留時間處出現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚吸收峰，陰性對照溶液在該處無吸收。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰與其他組分峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，陰性對照溶液在該處無吸收峰。理論板數(shù)以相應(yīng)色譜峰計均不低于10 000。

圖1 高效液相色譜圖A.供試品；B.混合對照品；C.陰性對照；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚Fig 1 HPLC chromatogramsA.test samples；B.mixed reference；C.negative control；1.aloeemodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、5、8、10、15、18、20 μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equation and linear ranges

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.31%、0.25%、0.27%、0.27%、0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取同一供試品（批號：20130315-01）溶液適量，分別于放置0、6、12、18、24、36 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.91%、1.86%、1.96%、1.31%、1.17%（n＝6），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：20130315-01）6 份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.70、4.69、1.24、2.03、0.75 mg/g，RSD分別為1.56%、1.53%、1.65%、1.80%，1.51%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20130315-01）9份，每份0.1 g，分別精密加入一定量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

精密稱定3批樣品各適量，每批2份，每份1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 測定波長的選擇

將配制的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對照品溶液，采用紫外-可見分光光度計進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 種蒽醌類成分在440 nm 波長左右均有較強(qiáng)吸收。因此，選擇440 nm為本研究的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7-8]，筆者曾試用甲醇-0.1%磷酸溶液（90∶10，V/V）為流動相，但蘆薈大黃素與大黃酸并未得到較好分離，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，考慮到加入適當(dāng)磷酸可以改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象，又嘗試以甲醇-0.23%磷酸溶液（85∶15，V/V）為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 種蒽醌類成分均可較好的分離，且峰形較好；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與相鄰峰分離度分別為1.568、2.890、4.723、6.106、9.995，理論板數(shù)分別在70 000、16 000、10 000、20 000、40 000以上。

3.3 含量限度的確定

測定100 粒滴丸，平均質(zhì)量為50 mg/丸。本試驗選取了3批滴丸進(jìn)行5 種蒽醌類成分的含量測定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚平均含量分別為0.703 72、4.693 09、1.241 60、2.033 54、0.749 34 mg/g，考慮到藥材來源、制備過程中的損耗、儲存中損失等諸多因素的影響，按平均值的80%計算[9]，暫定三黃滴丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量分別不得小于0.028 15、0.187 72、0.049 66、0.081 34、0.029 98 mg/丸。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝2）Tab 3 Results of samples content determination（n＝2）

3.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高

2010年版《中國藥典》（一部）對三黃片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了規(guī)定，對大黃中的大黃素和大黃酚進(jìn)行了含量測定，大黃中其余成分并未規(guī)定。本研究采用HPLC法，同時測定了大黃中5種蒽醌類成分，全面反映了成品質(zhì)量，提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可作為三黃滴丸中5種有效成分的含量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：457-458.

[2]王捧英，陳琳，侯芳潔，等.HPLC同時測定人參強(qiáng)心滴丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（5）：802.

[3]夏從龍，周濃，種佳.HPLC 測定不同廠家牛黃消炎片中5 種蒽醌類衍生物的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（2）：83.

[4]闞紅玉，宋殿榮，王躍飛，等.HPLC 法同時測定黃芩中5種黃酮類成分的含量[J].中國藥房，2010，21（11）：1 016.

[5]祝忠民，盧曉榮.HPLC法同時測定三黃片中4 種成分的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（5）：300.

[6]毛泉明，張鈺泉，葉福媛，等.用RP-HPLC 法測定三黃片中四種組分的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2009，9（4）：292.

[7]柳仁民，丁瑞芳.高效液相色譜法測定三黃片中蒽醌類衍生物的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2005，22（5）：411.

[8]王鈺瑩，馮偉紅，楊菲，等.“一測多評”法測定三黃片中的大黃蒽醌類成分[J].中國中藥雜志，2012，37（2）：212.

[9]李文霞，宋平順.HPLC法同時測定三黃片中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展，2011，35（4）：178.