仙人菇口服液的質(zhì)量標準研究

樂佳美，熊筱娟，陸文銓，樸淑娟，張 鳳#（.上海長征醫(yī)院藥學部，上海 00003；.宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000）

仙人菇口服液是第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院自制制劑，由淫羊藿、黃芪、枸杞、炒白術(shù)、人參等8味中藥組成，具有益氣填精、扶正固本的功效。該藥主要用于慢性消耗性疾病、疲勞綜合征等癥，對惡性腫瘤放、化療造成的貧血及免疫功能低下亦具有輔助的治療作用。仙人菇口服液在本院主要應(yīng)用于中晚期惡性腫瘤支持治療，療效確切，臨床應(yīng)用已近20年[1-2]。原質(zhì)量標準僅有常規(guī)檢查項目和對處方中淫羊藿、黃芪、枸杞的定性鑒別，尚未見有關(guān)其質(zhì)量控制的文獻報道。淫羊藿是仙人菇口服液的主要藥材，淫羊藿苷是其有效成分之一。淫羊藿苷是一種重要的生物活性成分，能增加心腦血管血流量、促進造血功能、免疫功能及骨代謝，具有補腎壯陽、抗衰老、抗腫瘤等功效。通過攻補兼施、益氣活血、扶正固本的方法，可提高中晚期惡性腫瘤患者的機體免疫機能，從而糾正患者的氣血兩虛的證候，穩(wěn)定病情，提高生存質(zhì)量。因此，為了提高產(chǎn)品質(zhì)量的專屬性、有效控制內(nèi)在質(zhì)量、保證臨床療效，筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定淫羊藿中的淫羊藿苷的含量，為建立仙人菇口服液的質(zhì)量控制方法提供參考。同時，在保留原標準的基礎(chǔ)上增加了對處方中人參、白術(shù)的薄層色譜（TLC）鑒別，以提高軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑的質(zhì)量標準。

1 材料

1260 型HPLC儀，包括G1311A四元泵、G1322A真空脫氣機、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G4212B 二極管陣列檢測器，ChemStation 軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Agilent 公司）；AG 22331 型Humberg 超高速離心機（德國Eppendorf 公司）；CPA225D 型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；WL-901 Vortex 型旋渦振蕩混和器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；SK7200H 型高頻超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率：350 W，頻率：53 kHz）。

仙人菇口服液（上海長征醫(yī)院制劑中心自制，批號：130806、130807、130808，規(guī)格：10 ml/支）；淫羊藿苷對照品（批號：110737～200415，純度：98%）、黃芪甲苷對照品（批號：110781～201314，純度：98%）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703～200424，純度：98%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈、醋酸和磷酸為色譜純，其他供薄層鑒別用試劑，包括正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、氫氧化鈉、氯仿、三氯甲烷、石油醚、硫酸、乙醇均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法定性鑒別

2.1.1 淫羊藿 取3 批樣品溶液各50 ml，分別用水飽和正丁醇提取3次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至干，殘渣加5 ml 甲醇溶解，作為供試品溶液。取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每ml 含1 mg 淫羊藿苷的溶液，作為對照品溶液。另取淫羊藿對照藥材10 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取2 次，每次40 ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇5 ml 溶解，作為對照藥材溶液。另取缺淫羊藿的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗[3]，吸取上述供試品溶液3 μl、對照藥材溶液和對照品溶液各2 μl、陰性對照溶液3 μl分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點。薄層色譜圖見圖1。

圖1 淫羊藿薄層色譜鑒別色譜圖A.365 nm熒光顯色；B.10%硫酸乙醇溶液顯色；1-3.供試品溶液（批號：130806、130807、130808）；4.對照藥材溶液；5.對照品溶液；6.陰性對照溶液Fig 1 TLC chromatogram of Epimedii FoliumA.TLC of 365 nm fluorescence；B.TLC of 10%H2SO4ethanol solution；1-3.test sample solution（sBatch No.130806，No.130807 and No.130808）；4.reference medicinal materials；5.reference substance solution；6.negative control solution

2.1.2 黃芪 取3 批樣品溶液各40 ml，分別加40%的氫氧化鈉溶液5 ml，搖勻，用水飽和正丁醇提取3次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，濾過，取濾液，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 ml含1 mg黃芪甲苷的溶液，作為對照品溶液。另取黃芪對照藥材10 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取2 次，每次40 ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，作為對照藥材溶液。另取缺黃芪的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗[3]，吸取上述供試品溶液3 μl、對照藥材溶液和對照品溶液各2 μl、陰性對照溶液3 μl 分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（20∶40∶22∶10，V/V/V/V）的下層溶液（10 ℃以下分層）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱5 min，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕褐色斑點。薄層色譜圖見圖2。

圖2 黃芪薄層色譜鑒別色譜圖1-3.供試品溶液（批號：130806、130807、130808）；4.對照藥材溶液；5.對照品溶液；6.陰性對照溶液Fig 2 TLC chromatogram of Astragali Radix1-3.test sample solution（sBatch No.130806，No.130807 and No.130808）；4.reference medicinal materials；5.reference substance solution；6.negative control solution

2.1.3 枸杞 取3批樣品溶液各50 ml，分別用乙酸乙酯提取3次，每次30 ml，合并乙酸乙酯提取液，減壓蒸干，殘渣加2 ml甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞對照藥材9 g，加水40 ml，加熱煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用乙酸乙酯提取2次，每次40 ml，合并乙酸乙酯提取液，減壓濃縮至5 ml，作為對照藥材溶液。另取缺枸杞子的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗[3]，吸取上述供試品溶液10 μl、對照藥材溶液5 μl、陰性對照溶液10 μl 分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸（3∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。薄層色譜圖見圖3。

圖3 枸杞薄層色譜鑒別色譜圖1-3.供試品溶液（批號：130806、130807、130808）；4.對照藥材溶液；5.陰性對照溶液Fig 3 TLC chromatogram of lycium barbarum1-3.test sample solution（sBatch No.130806，No.130807 and No.130808）；4.reference medicinal materials；5.negative control solution

2.1.4 白術(shù) 取3批樣品溶液各50 ml，分別用乙酸乙酯提取3次，每次30 ml，合并乙酸乙酯提取液，減壓蒸干，殘渣加三氯甲烷2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對照藥材1 g，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，同法制成對照藥材溶液。另取缺白術(shù)的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗[3]，吸取上述供試品溶液10 μl、對照藥材溶液5 μl、陰性對照溶液10 μl 分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（50∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱5 min，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點。薄層色譜圖見圖4。

圖4 白術(shù)薄層色譜鑒別色譜圖1-3.供試品溶液（批號：130806、130807、130808）；4.對照藥材溶液；5.陰性對照溶液Fig 4 TLC chromatogram of Atracty lodes.macrocephala1-3.test sample solutions（Batch No.130806，No.130807 and No.130808）；4.reference medicinal materials；5.negative control solution

2.1.5 人參 取“2.1.1”項下制得的供試品溶液，作為供試品溶液。取人參皂苷Rg1對照品適量，加甲醇制成每1 ml 升含1 mg 人參皂苷Rg1的溶液，作為對照品溶液。另取人參對照藥材10 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取2次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇5 ml 使溶解，作為對照藥材溶液。另取缺人參的陰性樣品適量，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB）試驗[3]，吸取上述供試品溶液2 μl、對照藥材溶液和對照品溶液各1 μl、陰性對照溶液2 μl 分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點。薄層色譜圖見圖5。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（30∶70，V/V），等度洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品1.02 mg，置于1 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液（1.02 mg/ml）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10 ml，置于50 ml量瓶中，精密加入50%乙醇40 ml，密塞，超聲處理30 min 后，放冷，再用50%乙醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 除淫羊藿外，其他各藥材按照仙人菇口服液的制備方法進行提取濃縮制成陰性對照樣品后，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

圖5 人參薄層色譜鑒別色譜圖1-3.供試品溶液（批號：130806、130807、130808）；4.對照藥材溶液；5.對照品溶液；6.陰性對照溶液Fig 5 TLC chromatogram of Panax.ginseng1-3.test sample solution（sBatch No.130806，No.130807 and No.130808）；4.reference medicinal materials；5.reference substance solution；6.negative control solution

2.2.5 專屬性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果，陰性對照溶液色譜中在淫羊藿苷色譜峰保留時間一致的位置上無色譜峰，表明其他藥材對淫羊藿苷的含量測定無影響，詳見圖6。

圖6 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液（批號：130806）；C.陰性對照溶液；1.淫羊藿苷Fig 6 HPLC chromatogramsA.reference solution；B.test sample solution（Batch No.130806）；C.negative control solution；1.icariin

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項下淫羊藿苷對照品溶液適量，加入甲醇稀釋制成每1 ml 含510.00、255.00、127.50、63.75、31.88、15.94、7.97 μg的系列溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得淫羊藿苷線性回歸方程為y＝20.436x－76.473（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在7.97～510.00μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 按“2.2.2”項下方法制備質(zhì)量濃度為510 μg/ml的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD為0.83%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：130806）適量，分別于提取后0、5、10、15、20、24 h 時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD為0.55%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取同一樣品（批號：130806）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷平均含量為305.98 μg/ml，RSD為0.45%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取同一批號（批號：130806）已知含量的樣品各適量，共6 份，分別精密加入與樣品中淫羊藿苷含量相等的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測定 取3 批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Result of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 TLC法

經(jīng)比較，淫羊藿苷的薄層鑒別中噴以10%硫酸乙醇溶液顯色也可見清晰斑點，且效果比《中國藥典》中置于紫外光燈（365 nm）下檢視所得熒光斑點更好。另外，TLC 中使用的顯色劑中水的含量對斑點顏色和形狀影響很大，無水乙醇和硫酸放置過久，含水量增加，顯色劑顯色不明顯；且試驗中易受邊緣效應(yīng)干擾而使樣品斑點比移值（Rf）和形狀異常變化。因此，嚴格控制展開劑中水的比例且現(xiàn)配現(xiàn)用，將展開缸在展開前進行預(yù)飽和，并將薄層板置于展開缸中間，可顯著改善斑點的形狀和顏色，減小邊緣效應(yīng)，使斑點清晰可見。

3.2 對照品純度檢查方法

采用二極管陣列檢測器檢測，樣品在190～400 nm波長范圍內(nèi)，除樣品峰外未檢測到其他峰，樣品峰峰面積百分比達到100%；且增加進樣量至樣品出現(xiàn)平頭峰時，仍未檢測出其他色譜峰。樣品峰的峰純度分析報告顯示，峰純度達到98%，理論板數(shù)為13 463。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 色譜柱的選擇 本試驗對3種型號的C18柱進行了考察（Dikma Diamonsil C18、Sapphire C18、Agilent Eclipse XDB-C18）。結(jié)果表明，三者均能較好地分離淫羊藿苷且峰形較好，出于成本考慮，選用Dikma Diamonsil C18。

3.3.2 柱溫的選擇 筆者考察了不同柱溫（25、30、35 ℃）對分離效果的影響。結(jié)果表明，30 ℃條件下的分離效果略優(yōu)，故選用30 ℃為本研究的柱溫。

3.3.3 流動相的選擇 本試驗按照2010 年版《中國藥典》（一部）[3]并結(jié)合其他相關(guān)文獻[4-15]考察淫羊藿苷的流動相條件，分別對乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸5種流動相系統(tǒng)進行測定試驗。結(jié)果表明，乙腈-水為流動相，采用等度洗脫時淫羊藿苷出峰時間較晚，且色譜峰的對稱性不好；加入醋酸或磷酸的流動相系統(tǒng)可提高淫羊藿苷出峰時間，但0.1%醋酸和0.05%磷酸的分離度較差，0.1%和0.2%磷酸條件下分離效果均較好?？紤]到高濃度的磷酸會對色譜柱造成一定損傷，故選擇乙腈-0.1%磷酸（30∶70，V/V）作為流動相，并且每次分析結(jié)束時加強對色譜柱和液相系統(tǒng)的沖洗和維護。

3.3.4 檢測波長的選擇 取淫羊藿苷對照品溶液適量，在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在270 nm波長處有最大吸收。參照2010年版《中國藥典》（一部）[3]淫羊藿苷的檢測波長，并結(jié)合其他相關(guān)文獻[4-15]，最終選擇270 nm為檢測波長。

3.4 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

3.4.1 提取方法的選擇 精密量取10 ml 仙人菇口服液3 份，分別進行以下處理。①萃取法：加乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇50 ml溶解；②超聲法：置于50 ml量瓶中，加甲醇40 ml，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；③直接進樣法：置于50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。使上述各樣品取樣量一致，測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果，3種方法的質(zhì)量濃度分別為262.99、309.01、300.35 μg/ml，表明超聲法提取效果略優(yōu)于萃取法和直接進樣法，故選用超聲法。

3.4.2 提取溶劑的選擇 精密量取10 ml 仙人菇口服液4 份，分別加入不同溶劑（50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、95%乙醇）進行超聲提取。使上述各樣品取樣量一致，測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果，質(zhì)量濃度分別為252.68、267.36、279.23、271.88 μg/ml，表明用50%乙醇作為提取溶劑時的提取效果較好，故選用50%乙醇作為提取溶劑。

3.4.3 提取藥液比的選擇 精密量取10 ml 仙人菇口服液3份，分別采用不同提取藥液比（1∶2、1∶4、1∶10，V/V）進行超聲提取。使上述各樣品取樣量一致，測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果，質(zhì)量濃度分別為179.69、285.51、274.77 μg/ml，表明當提取藥液比為1∶4 時樣品中淫羊藿苷含量最高，提取效果最好，故采用提取藥液比為1∶4。

3.4.4 提取時間的選擇 精密量取10 ml 仙人菇口服液3 份，分別采用不同超聲時間（15、30、60 min）進行超聲提取。使上述各樣品取樣量一致，測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果，質(zhì)量濃度分別為265.89、272.37、270.14 μg/ml，表明超聲30 min時提取效果略優(yōu)于其他時間，故采用超聲提取30 min。

綜上所述，該法快速、準確、操作簡便，可作為仙人菇口服液的質(zhì)量控制標準。

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