固相萃取-高效液相色譜法快速測定飲料中3種堿性橙含量

蔡燕斌 丁萍 劉月紅

摘 要：目的：建立了一種固相萃取-高效液相色譜法快速測定飲料中的堿性橙2（chrysoidine G，CDG）、堿性橙21（orange G，AOG）和堿性橙22（astrazon orange R，AOR）共3種禁用色素添加劑的方法。方法：樣品采用C18-SPE小柱凈化，洗脫液在35 ℃下用氮氣吹至近干后用定容液溶解并定容，過有機相濾膜后在Agilent XDB C18色譜柱上，以20 mmol·L-1的乙酸銨溶液和甲醇（體積比為35∶65）作為流動相進行分離，采用二極管陣列檢測器（DAD）在449 nm波長處檢測CDG，在485 nm 波長處檢測AOG及AOR，以外標峰面積法定量。結果3種堿性橙染料在0.50～20.0 mg·L-1濃度范圍內線性關系較好，方法回收率為86.8%～96.5%，相對標準偏差均小于2%（n=6），方法的檢出限為0.01 mg·kg-1。結論：本方法操作簡便、快速、準確，可適用于美年達和芬達等橙色飲料中堿性橙的檢測。

關鍵詞：高效液相色譜法;固相萃取;堿性橙染料;飲料

Abstract：Objective： To establish a SPE HPLC method for the rapid determination of three banned pigment additives in beverages， namelychrysoidine G （CDG） astrazon orange G （AOG）and astrazon orange R （AOR）. Methods： Samples were purified by C18-SPE small column， the eluate was blown to near dry with nitrogen at 35 ℃， dissolved and fixed volume with fixed volume solution， filtered by organic phase membrane， separated on Agilent XDB-C18 column with 20 mmol·L-1 ammonium acetate solution and methanol （volume ratio 35∶65） as mobile phase， and diode array detector was used for the determination of CDG at 449 nm and AOG and AOR at 485 nm with external standard method for quantification. Results： the linear relationship of the three basic orange dyes was good in the concentration range of 0.50～20.0 mg·L-1. The average recoveries were 86.8%～96.5% and the relative standard deviations were less than 2% （n=6）. The detection limits of the method were 0.01 mg·kg-1. Conclusion： The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of basic orange in orange drinks such as Mirinda， and Fanta.

Key words：High performance liquid chromatography; Solid phase extraction; Basic orange dye; Beverage

堿性橙染料是一類堿性工業(yè)染料，主要用于紡織品、木制品及皮革制品的染色，根據《中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標準》的相關規(guī)定，堿性橙染料是禁止用作食品添加劑的化學制品。由于堿性橙染料比檸檬黃、日落黃等水溶性染料更易上色且不易褪色，因此一些不法商販將堿性橙染料用于黃魚、辣椒、飲料和腐竹等豆制品的染色，以次充好，嚴重危害消費者的身體健康。

食品中禁用的堿性橙染料主要有3種，包括堿性橙2（CDG）、堿性橙21（AOG）及堿性橙22（AOR）。目前主要有高效液相色譜法（HPLC）[1]、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[2]和超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[3]等檢測方法。食品檢測的國家標準主要是GB/T 23496-2009《食品中禁用物質的檢測 堿性橙染料 高效液相色譜法》[4]，該方法中對于飲料等液體樣品的前處理方法操作時間長、過程易損失，堿性橙染料回收率不好。本研究主要針對橙色飲料美年達、芬達和統(tǒng)一鮮橙多3種基質，采用固相萃取的前處理方法，用高效液相色譜法進行分離檢測，建立一套簡便、快速、準確的測定食品中堿性橙含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

美年達和芬達等液體樣品均購自本地超市和市場。

1.2 儀器與試劑

甲醇、乙醇（色譜純，上海安譜公司）;乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;標準品堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22（純度>88%，上海安譜公司）。所用試劑均為色譜純，試驗用水為一級水。Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;氮吹儀（美國ORGANOMATION ASSOCIATES INC.）;固相萃取儀（美國Agela Technologies）;渦旋混合器（德國IKA）;電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合標準系列溶液的配制

①1 000 mg·L-1混合標準儲備液。準確稱取堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22各約10 mg（按純度折算為100%），用甲醇溶解并定容至10 mL。②100 mg·L-1混合標準中間溶液。取混合標準儲備液1.0 mL，用定容液定容至10 mL。③混合標準系列工作溶液。將混合標準中間溶液用定容液逐級稀釋，配制成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1和 20.0 mg·L-1的混合標準系列工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。定容液為65%體積的甲醇和35%體積的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液的混合溶液。

1.3.2 儀器工作條件

Agilent XDB C-18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：A：0.02 mol·L-1乙酸銨溶液;B：甲醇;等梯度洗脫條件：A，35%;B，65%。流速：1.0 mL·min-1;柱溫：40 ℃;檢測波長：堿性橙2：449 nm;堿性橙21、堿性橙22：485 nm。進樣量：20 μL。檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）。

1.3.3 試驗方法

將飲料樣品混勻，稱取10 g（準確至0.01 g）樣品，過Cleanert S C18-SPE固相萃取柱（2 g/12 mL），棄去流出液，最后抽干，再加10 mL無水乙醇洗脫固相萃取柱，控制2滴/s的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，最后抽干小柱，在35 ℃下用氮氣將洗脫液吹至近干，加入1.0 mL定容液，渦旋30 s溶解殘留物，經0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。按色譜峰的保留時間定性，以峰面積外標法定量。

2 結果與分析

2.1 洗脫液類型和體積的選擇

分別采用10 mL乙醇、10 mL定容液、5 mL乙醇+5 mL定容液作為洗脫液，經過試驗，發(fā)現(xiàn)由于定容液中有35%的水，所以10 mL乙醇氮吹干得最快，5 mL乙醇+5 mL定容液次之，10 mL定容液最慢，在液相上檢測時用10 mL乙醇作為洗脫液3種堿性橙回收率最高，故用10 mL乙醇作為洗脫液。洗脫液乙醇體積分別為5、10、15 mL和20 mL時，試驗結果見表1，結果表明，采用5 mL乙醇洗脫回收率不高，10 mL乙醇洗脫回收率較好，用15 mL乙醇和20 mL乙醇洗脫回收率與10 mL乙醇差不多，但因氮吹時間太長，故選用10 mL乙醇洗脫最佳。

2.2 氮吹溫度的選擇

分別選用20、30、35、40 ℃和50 ℃作為氮吹溫度，經過試驗，發(fā)現(xiàn)在20 ℃時氮吹時間較長，3種堿性橙回收率極不穩(wěn)定，在40 ℃和50 ℃堿性橙2受溫度的影響較大，在35 ℃時3種堿性橙回收率最高，試驗結果見表2。故選用35 ℃作為氮吹溫度。

2.3 最終定容溶液類型的選擇

分別用1.0 mL甲醇和1.0 mL定容液作為最終定容溶液，經過試驗，用1.0 mL定容液作為最終定容溶液，在液相中檢測時3種堿性橙峰型較窄較好，峰高較高，用1.0 mL甲醇時峰型較寬較差，故選用1.0 mL定容液作為最終定容溶液。

2.4 樣品調PH值的選擇

芬達橙味碳酸飲料PH值在4左右，用稀氨水調節(jié)PH值至7左右，進行試驗，結果表明，樣品pH值在4左右時3種堿性橙2、21、22的回收率分別為89.5%、96.2%、94.5%，pH值在7左右時堿性橙2、21、22的回收率分別為88.7%、73.3%、68.8%，故樣品采用不調PH值直接檢測。

2.5 干擾試驗

在色譜條件下，食品中常見的食用色素檸檬黃、日落黃、亮藍、胭脂紅、誘惑紅和添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、咖啡因在449、485 nm處幾乎無吸收，均不會干擾堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22的測定。

2.6 線性關系及檢出限

對堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22等3種堿性橙混合標準溶液系列進行測定，在0.5～20.0 mg·L-1濃度范圍內峰面積與溶液濃度之間呈一定的線性關系，以信噪比為3（S/N=3）計算檢出限，結果見表3。

2.7 回收率實驗

按照試驗方法對基底濃度分別為0的美年達和芬達分別進行測定，同時做加標回收實驗，結果見表4。

3 結論

本研究采用固相萃取-高效液相色譜法對美年達和芬達2種飲料樣品測定違禁添加色素堿性橙的含量，3種堿性橙染料在0.5～20.0 mg·L-1濃度范圍內線性關系良好，方法回收率為86.8%～96.5%。該方法可適用于美年達和芬達等飲料樣品中堿性橙染料的檢測，同時具有操作過程簡單、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點。

參考文獻：

[1]戚美靜，楊冀艷，朱昌磊，等.高效液相色譜法測定食品中的堿性橙染料[J].食品安全質量檢測學報，2016，7（6）：2523-2528.

[2]劉艷霞，尹建波，蘇 芳，等.反相高效液相色譜法測定堿性橙Ⅱ[J].化學工程與裝備，2014（5）：165-166.

[3]李 娟，丁曉明，劉丹丹，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時檢測辣椒制品中4種工業(yè)染料[J].河南農業(yè)科學，2014，43（5）：130-133.

[4]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 23496-2009 食品中禁用物質的檢測 堿性橙染料 高效液相色譜法[S].北京：中國標準出版社，2009.