慢病毒載體介導(dǎo)的Nrf2表達(dá)下調(diào)對(duì)肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

蔡陳效 鉏莉 王曉晗

[摘要] 目的 觀察重組慢病毒載體介導(dǎo)Nrf2表達(dá)下調(diào)對(duì)肝星狀細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，同時(shí)探討其可能的作用機(jī)制。 方法 利用重組DNA技術(shù)將特異性shRNA序列插入慢病毒表達(dá)載體pGLV3.GFP中，形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA，將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，隨后進(jìn)行病毒包裝、滴度測(cè)定、轉(zhuǎn)染率計(jì)算。采用實(shí)時(shí)熒光定量、Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6細(xì)胞）Nrt2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，利用Tunel染色法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)對(duì)HSC-T6細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 構(gòu)建的重組病毒載體 LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T細(xì)胞。激光共聚焦顯示空白組細(xì)胞凋亡率低于A組和B組，與A組比較，B組的細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法結(jié)果顯示空白組Nrf2 mRNA水平高于A組和B組（P<0.05），與A組比較，B組mRNA水平升高（P<0.05）。Western blot法顯示空白組Nrf2蛋白水平高于A組和B組（P<0.05），與A組比較，B組蛋白水平升高（P<0.05）。與空白組相比，A組和B組PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），Bax蛋白減少（P<0.05），其中A組PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平較B組增加（P<0.05），Bax蛋白水平低于B組（P<0.05）。 結(jié)論 Nrf2基因的shRNA慢病毒載體pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在體外可抑制肝星狀細(xì)胞活化，其作用機(jī)制可能與通過抑制PI3K-Akt通路促肝星狀細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 慢病毒載體;HSC-T6細(xì)胞;Nrf2;PI3K-Akt通路;凋亡

[中圖分類號(hào)] R575.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）13-0015-04

[Abstract] Objective To observe the influence of down-regulated expression of Nrf2 mediated by recombinant lentiviral vectors on biological behaviors of hepatic stellate cells， and to explore the likely mechanism. Methods The specific shRNA sequence was inserted into the lentiviral vector pGLV3.GFP by the recombinant DNA technique to form pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA， which was transfected to 293T cells. Then， virus packaging， titre determination and calculation of transfection efficiency were performed. The expression of Nrt2 mRNA and protein in transfected hepatic stellate cells（HSC-T6 cells） was determined by real time quantitative PCR and Western blot， the apoptosis of HSC-T6 cells was detected by the Tunel staining method， and the protein levels of PI3K， Akt， p-Akt， p-Bad， Bcl-2 and Bax in HSC-T6 cells were determined at the same time. Results The constructed recombinant virus vector LV3-H1-GFP-shRNA Can effectively infect 293T cells. It was found by laser confocal scanning that the apoptosis rate was lower in the blank group than in group A and group B， and the apoptosis rate was lower in group B than in group A（P<0.05）. It was found by real time quantitative PCR that the Nrf2 mRNA level was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the Nrf2 mRNA level was higher in group B than in group A（P<0.05）. It was found by Western blot that the Nrf2 protein level was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the Nrf2 protein level was higher in group B than in group A（P<0.05）. The protein levels of PI3K， p-Akt， p-Bad， and Bcl-2 were lower in the blank group than in group A and group B（P<0.05）， and the protein level of Bax was higher in the blank group than in group A and group B（P<0.05）. The protein expression of PI3K， p-Akt， p-Bad， and Bcl-2 were higher in group A than in group B（P<0.05）， and the protein expression of Bax was lower in group A than in group B（P<0.05）. Conclusion The shRNA lentiviral vector pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA of Nrf2 gene can inhibit the activation of hepatic stellate cells in vitro， and its mechanism may be related with promoting apoptosis of hepatic stellate cells by inhibiting the PI3K-Akt pathway.

[Key words] Lentiviral vector; HSC-T6 cell; Nrf2; PI3K-AKT pathway; Apoptosis

細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積導(dǎo)致肝纖維化的出現(xiàn)，有研究[1，2]顯示肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellatecells，HSCs）的激活是導(dǎo)致肝纖維化的重要環(huán)節(jié)，任何因素導(dǎo)致HSCs的生物行為學(xué)改變均可導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此可以推測(cè)，各種干預(yù)措施（藥物、各種刺激等）如果能夠抑制HSCs的生物行為及功能，就可在一定程度上減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。有研究[3]顯示抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的表達(dá)可抑制HSC活化，從而減輕肝纖維化程度，但其是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)目前尚不可知?；谏鲜霰尘凹把芯炕A(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建針對(duì)大鼠Nrf2基因的慢病毒載體，進(jìn)一步研究Nrf2影響HSCs的生物行為的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Gibco公司）;人肝星狀細(xì)胞HSC-T6（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院細(xì)胞中心），Liprofectamine2000（美國Invitrogen公司），Annexin-FITC/PI細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（Invitrogen公司），PVDF膜（美國Millipore公司），二甲基亞砜（DMSO）（廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），倒置相差熒光顯微鏡（美國OLYMPUS公司），酶標(biāo)自動(dòng)分析儀（美國BIO-BAD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

將HSC-T6復(fù)蘇后常規(guī)置于DMEM高糖培養(yǎng)基中（10% 胎牛血清+1%卡那霉素和新霉素）培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境模擬細(xì)胞生物體內(nèi)環(huán)境，條件如下：穩(wěn)定的溫度（37°C）、穩(wěn)定的CO2水平（5%）、恒定的酸堿度（pH值：7.2～7.4）、較高的相對(duì)飽和濕度（95%），2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞以5×104/mL密度接種于24孔板中，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞生長(zhǎng)速度略有不同，一般是保證次日進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的匯合率在80%～90%。

1.3 慢病毒載體構(gòu)建

此過程由中國豐暉生物技術(shù)有限公司完成，參照GenBank將大鼠Nfe2l2基因（NM 031789.2）的cDNA作為目標(biāo)模板，遵循化學(xué)合成siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇RNAi靶序列，在完成Blast基因組同源性分析后合成相應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，隨后對(duì)慢病毒載體進(jìn)行測(cè)序鑒定證明載體構(gòu)建成功，隨之進(jìn)行慢病毒載體包裝及測(cè)定滴度。

1.4 重組病毒感染靶細(xì)胞

將293T細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至細(xì)胞的匯合率在80%～90%時(shí)摒棄細(xì)胞原有的培養(yǎng)基，隨后加入2 mL滅菌的D-Hanks溶液洗滌細(xì)胞生長(zhǎng)面，然后棄去該溶液，加入1 mL胰酶消化液，充分混勻后將混合液置于37℃消化約3～5 min，加入2 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，用刻度吸管吹打數(shù)次后形成單細(xì)胞懸液，隨后將細(xì)胞稀釋至密度為3×105/mL后接種于96孔板中，充分混勻后在模擬細(xì)胞生物體內(nèi)環(huán)境下（37℃、5%CO2、飽和濕度）培養(yǎng)24 h，仔細(xì)吸取96孔板中舊的培養(yǎng)基，每孔加入重組慢病毒（A組）和空載病毒（B組）5×107TU，設(shè)立未添加病毒的空白細(xì)胞對(duì)照組，每孔中加入終濃度為5 μg/mL的Polybrene，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度中轉(zhuǎn)染12 h，PBS沖洗換液，加入150 μL 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。利用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞的Nrf2表達(dá)水平變化及轉(zhuǎn)染率的差異。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靶細(xì)胞中Nrf2 mRNA的表達(dá)

將細(xì)胞加入Trizol 提取液提取細(xì)胞總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI中Genebank基因庫的設(shè)計(jì)引物序列得出：Mfn2的上游引物序列為5'-GATGACAGAG-GAAGTGGAAAGGC-3'，下游引物序列為5'-ACAGACACAGGAAGA-AGGGGCT-3';反應(yīng)體系為 20 μL，逆轉(zhuǎn)錄過程 ：95℃（3 min）→95℃變性（20 s）→55℃退火（30 s）→72℃延伸（3 min），30個(gè)循環(huán)。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，GAPDH的上游引物序列為5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物序列為5'-TTTGAG-GGTGCAGCGAACTT-3'。通過ABI7500軟件獲得檢測(cè)指標(biāo)Ct（cycle threshold）值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。以空白組ΔCt值作為校正，軟件根據(jù)2-ΔΔCt數(shù)值計(jì)算得出檢測(cè)指標(biāo)基因濃度水平。

1.6 Western blot檢測(cè)靶細(xì)胞中Nrf2、PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調(diào)為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結(jié)束后將凝膠取出，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，遵循膠在負(fù)極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時(shí)間依據(jù)各指標(biāo)分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對(duì)固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)染，看電泳帶是否清晰，證實(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)轉(zhuǎn)移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，每次5 min，分別加入抗Nrf2、PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax及β-actin一抗抗體孵育，4℃過夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記與一抗相抗的二抗IgG（1：2000）室溫50 min，TBST洗3次，每次5 min。將濾膜放人配好的顯色液中反應(yīng)1 min，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.7 Tunel染色

采用Tunel試劑盒對(duì)各組生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)的HSC-T6細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞核及凋亡神經(jīng)元細(xì)胞分別呈現(xiàn)藍(lán)色熒光及綠色熒光，采用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)腦片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image.ProPlus圖像分析處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞數(shù)的計(jì)算。凋亡細(xì)胞率=（綠色熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)/DAPI染色的總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-Way ANOVA單因素方差分析，Western Blott及Tunel染色圖片利用oringe軟件及Image J軟件進(jìn)行作圖及圖片處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染靶細(xì)胞情況及轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

結(jié)果顯示利用慢病毒載體成功感染了293T細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察各組293T細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的重組病毒載體LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T細(xì)胞。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出最適MOI為10，轉(zhuǎn)染效率達(dá)75%。見封三圖1。

2.2 各組HSC-T6細(xì)胞中Nrf2 mRNA的表達(dá)變化

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)HSC-T6細(xì)胞中Nrf2 mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，將空白組細(xì)胞的Nrf2 mRNA設(shè)置為1，結(jié)果顯示LV3-H1-GFP-shRNA后A組細(xì)胞Nrf2 mRNA相對(duì)水平為（0.28±0.06），B組Nrf2 mRNA相對(duì)水平為（0.59±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.39，P=0.01<0.05）。

2.3 各組HSC-T6細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)變化

利用Western blot法對(duì)HSC-T6細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示LV3-H1-GFP-shRNA后細(xì)胞Nrf2蛋白下降，A組Nrf2/β-actin比值為（0.32±0.01），B組Nrf2/β-actin比值為（0.71±0.02），空白組Nrf2/β-actin比值為（1.15±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.32，P=0.01<0.05）。見圖1、2。

2.4 各組HSC-T6細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax表達(dá)情況

采用Western blot對(duì)各組HSC-T6細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。與其他兩組相比，A組PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)量增加，Bax蛋白減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、4及表1。

2.5 各組HSC-T6細(xì)胞凋亡情況

經(jīng)過激光共聚焦觀察可知，空白組幾乎未見綠色熒光，細(xì)胞凋亡率為（0.51±0.14）%，慢性病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞均較空白組多，A組細(xì)胞凋亡率為（2.15±0.17）%，B組細(xì)胞凋亡率為（1.63±0.31）%，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.41，P=0.00<0.05），A組綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目較B組多。見封三圖2。

3 討論

細(xì)胞脂滴在肝臟受到內(nèi)源性或外源性刺激時(shí)消失，處于靜態(tài)的HSCs可轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維樣細(xì)胞，這一過程亦稱之為“活化”[4]，HSCs生物學(xué)行為表現(xiàn)是影響肝纖維化進(jìn)程的核心環(huán)節(jié)[5]，如若治療不及時(shí)或不恰當(dāng)，肝纖維化則可進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化甚至肝癌[6]。近年來不少研究[7-9]證實(shí)肝纖維化程度的減弱與HSC活化程度減少有關(guān)，而HSCs表型的轉(zhuǎn)化并非HSCs活化的關(guān)鍵，凋亡才是影響HSCs活化的中心環(huán)節(jié)。HSCs凋亡不破壞HSCs細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)完整性，亦不會(huì)影響HSCs微環(huán)境，僅削減HSCs的活化細(xì)胞數(shù)量。Nrf2是CNC 轉(zhuǎn)率因子家族的重要因子之一，大量分布于組織器官中，對(duì)其發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)[10]。當(dāng)機(jī)體接受氧化應(yīng)激信號(hào)時(shí)，Nrf2會(huì)產(chǎn)生核移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合ARE，隨之激活其下游的大量活性因子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)抵御氧化應(yīng)激損傷。有數(shù)據(jù)[11-13]顯示，當(dāng)肝星狀細(xì)胞處于氧化應(yīng)激環(huán)境中時(shí)可被活化，而Nrf2是肝星狀細(xì)胞中與氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)的中樞調(diào)節(jié)因子[14]，Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件相互作用后調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞氧化平衡及對(duì)凋亡信號(hào)的敏感度[15，16]，Nrf2的減少或缺失可導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞功能障礙，減少活化狀態(tài)，加速凋亡，從而改善肝臟纖維化程度[17]。本研究成功構(gòu)建針對(duì)大鼠Nrf2基因有效的shRNA慢病毒載體，通過熒光顯微鏡證實(shí)重組病毒有效感染了靶細(xì)胞，并經(jīng)過PCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)了慢病毒載體有效抑制了Nrf2的基因和蛋白的表達(dá)，與此同時(shí)利用Tunel染色發(fā)現(xiàn)隨著Nrf2表達(dá)水平的下降，肝星狀細(xì)胞的凋亡明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了抑制Nrf2的表達(dá)可抑制HSC的活化。

PI3K/Akt信號(hào)通路是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]，PI3K依賴性的Akt激活可以使促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白Bax（BCL-2-associated X protein）的Ser136位點(diǎn)磷酸化而失活，從而誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，與此同時(shí)對(duì)Bcl-2的抗凋亡效應(yīng)亦產(chǎn)生了抑制作用[19]。此外，被活化的Akt亦可直接作用于線粒體的細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子，抑制其分泌，從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的目的[20]。Akt磷酸化后使得其下游關(guān)鍵蛋白分子Bad磷酸化，Bad蛋白與伴侶蛋白結(jié)合，從而使Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，而Bax的蛋白表達(dá)量下降，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用[21]。本研究通過Western blot顯示轉(zhuǎn)染慢病毒過表達(dá)載體pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA可導(dǎo)致PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少，Bax蛋白及凋亡率增加，說明慢病毒介導(dǎo)的RNAi能有效抑制靶細(xì)胞中Nrf2基因和蛋白表達(dá)的同時(shí)可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡，抑制其活化，減少肝纖維化程度。

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（收稿日期：2019-09-26）