組織樣品大氣壓質(zhì)譜分析研究

王雨芬 盧海艷 張華 陳煥文

摘要組織樣品中含有豐富的生物分子信息，是代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，大氣壓質(zhì)譜分析（AMS）技術(shù)因具有無需樣品預(yù)處理即可直接獲取組織樣品中生物分子種類及含量信息的能力，在組織樣品分析中突顯了高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性、低樣品耗量的特點(diǎn)，已逐漸成為分析組織樣品不可或缺的手段。本文以常見的植物、動物和臨床術(shù)后組織樣品為代表，介紹了近年來AMS技術(shù)在組織樣品分析中的應(yīng)用進(jìn)展，結(jié)合成像技術(shù)，討論了組織樣品AMS的發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞大氣壓質(zhì)譜; 組織分析; 質(zhì)譜成像; 評述

1引 言

組織樣品中含有豐富的代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)等生物分子，是采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)（包括液相色譜質(zhì)譜（LCMS）技術(shù)和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）技術(shù)等）對組織樣品分析時，需要對樣品進(jìn)行研磨、萃取、分離等預(yù)處理，極大地制約了樣品高通量分析的實(shí)際需求。AMS技術(shù)為直接分析復(fù)雜基體樣品提供了可能[2]，例如，電噴霧解吸電離（DESI）技術(shù)[3]、空氣動力輔助解吸電噴霧電離（AFADESI）技術(shù)[4]、表面解吸化學(xué)電離（DAPCI）技術(shù)[5]、實(shí)時直接分析（DART）技術(shù)[6]、智能手術(shù)刀（iKnife）[7]、SpiderMass[8]及“神筆”（MasSpec Pen）[9]等已廣泛應(yīng)用于各類組織樣品的研究，并為組織樣品的大氣壓質(zhì)譜成像（MSI）提供了新的思路[10]。

大氣壓質(zhì)譜分析的顯著特點(diǎn)是：各種復(fù)雜實(shí)際樣品無需預(yù)處理或僅需簡單預(yù)處理，常溫常壓條件下對待測樣本中目標(biāo)分子進(jìn)行電離，以質(zhì)譜儀進(jìn)行高靈敏、高選擇性在線檢測。因此，只要符合這一特征的技術(shù)，都可認(rèn)為是大氣壓質(zhì)譜分析的范疇。目前，已有很多綜述對AMS技術(shù)原理及其發(fā)展歷程做了詳細(xì)介紹[11～13]。因此，本文介紹了近年來各種大氣壓質(zhì)譜分析及成像技術(shù)在植物、動物和臨床術(shù)后組織樣品分析中的應(yīng)用，展望了其在組織樣品分析方面的發(fā)展趨勢和面臨的挑戰(zhàn)。

2植物組織分析

植物組織的大部分天然產(chǎn)物在人們生產(chǎn)生活中發(fā)揮著重要的作用，是傳統(tǒng)藥物研制及香料、色素、調(diào)味品、化妝品等重要工業(yè)原料的來源，但是也包含了很多有害物質(zhì)（如毒性成分或者農(nóng)殘），給人體健康帶來了潛在的危險。傳統(tǒng)分析方法耗時費(fèi)力，不適合大量樣品篩選。AMS技術(shù)可以快速、原位分析不同維度的組織樣本，如部分組織的表層、淺表層甚至是組織內(nèi)部，同時結(jié)合成像技術(shù)表征了組織中分子的分布信息。

2.1組織表層分析

植物不同部位組織的質(zhì)地及其含有的化合物在性質(zhì)上具有一定的差異性，因此選擇適宜的AMS技術(shù)對其進(jìn)行靈敏檢測是必要的?；陔妵婌F離子化的DESI依靠噴霧溶劑從樣品表面解吸目標(biāo)物，是目前使用最廣泛的一種技術(shù)。例如，部分植物組織質(zhì)地相對較硬，傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)需進(jìn)行常規(guī)研磨后再用溶劑進(jìn)行萃取，操作過程比較耗時且費(fèi)力。Klejdus等[14]首次對桂皮進(jìn)行簡單處理，運(yùn)用DESIMS對其中的酚類代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，為分析傳統(tǒng)藥物中的活性成分提供了有效手段。另外，AMS 技術(shù)還可鑒別植物表面的農(nóng)殘等有害物質(zhì)，為保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供了技術(shù)支撐。例如，Rocca等[15]采用DESIMS定量測定了橄欖和葡萄藤葉片表面的樂果、肟菌酯、戊唑醇等農(nóng)殘。植物表皮細(xì)胞的腺毛能夠分泌特殊的代謝產(chǎn)物，可根據(jù)檢測的化合物推測且闡明細(xì)胞類型，為研究植物代謝新機(jī)制提供新手段[16]。傳統(tǒng)的LCMS等使用研磨法進(jìn)行預(yù)處理，不能實(shí)時在線分析，無法確定細(xì)胞類型。Freund等[17]利用葉噴霧質(zhì)譜（LeafsprayMS）技術(shù)，直接分析了美國甘草完整葉片組織表面的異黃酮、黃酮等代謝成分，快速鑒定了腺毛層的代謝產(chǎn)物，有助于闡明細(xì)胞類型（圖1A）。另外，基于等離子體的大氣壓電離方法（包括DART、介質(zhì)阻擋放電電離（DBD）、低溫等離子體探針電離（LTP）等），因其簡單、便攜、低功耗等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到植物組織分析中。例如，Prchalova等[18]運(yùn)用DARTMS直接表征了多種草藥茶中不同部位的根、葉、花和果實(shí)中的糖苷、黃酮類、酚類和萜烯類成分，利用主成分分析法（PCA）區(qū)分了不同種類的中草藥且有效監(jiān)控其品質(zhì)問題。采用激光促進(jìn)樣品解吸的大氣壓質(zhì)譜離子源，其相比于單一的離子源（電噴霧或等離子體），將二者耦合不僅縮短了時間，還減少了所需樣本量，更有效地促進(jìn)解吸，具有更高的靈敏度[19]。例如，Bierstedt等[20]將激光剝蝕（LA）與DBDMS結(jié)合分析了辣椒中的生物堿，大大提高了靈敏度和響應(yīng)時間等分析性能（圖1B）。

目前，研究人員對植物防御功能的研究較多。AMS技術(shù)為從分子水平揭示植物防御功能機(jī)理提供了手段，其不僅為設(shè)計開發(fā)具備耐受環(huán)境侵害且高產(chǎn)量的農(nóng)作物產(chǎn)生影響，一定程度上也為闡明人類疾病發(fā)生機(jī)制提供參考。如Martinez Jarquin等[21]采用LTPMS在線監(jiān)測了煙草組織受損后尼古丁的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)煙草組織受損后，其根部組織會合成尼古丁，然后運(yùn)輸?shù)饺~片，評估了其可能存在的生物防御效應(yīng)。另外，植物防御機(jī)制涉及的有機(jī)硫化物，因其留存時間不長，在一般分析技術(shù)條件下容易降解，大氣壓質(zhì)譜技術(shù)可以彌補(bǔ)其缺陷，對其進(jìn)行原位追蹤。He等[22]采用DARTMS技術(shù)成功追蹤了部分蔥屬類中的硫化物，結(jié)合同位素標(biāo)記對其進(jìn)行了定量分析。

2.2組織內(nèi)部分析

大氣壓質(zhì)譜分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分析植物組織的淺表層或表層，然而大部分常規(guī)離子源很難從組織內(nèi)部獲取生物信息，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。針對這些問題，本課題組于2013年提出了內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜（iEESIMS）技術(shù)[23，24]，在不破壞樣品的前提下直接獲取凝聚態(tài)整體組織樣品（如動植物和人體組織）內(nèi)部的化學(xué)信息。例如， Zhang等[25]運(yùn)用iEESIMS鑒定了臍橙中的高極性化合物（氨基酸、生物堿、糖）。另外，iEESIMS在監(jiān)測組織中的不穩(wěn)定活性物質(zhì)體現(xiàn)了其優(yōu)勢。例如，Zhang等[26]運(yùn)用iEESIMS對大蒜中酶促反應(yīng)進(jìn)行了直接表征，成功監(jiān)測了不同外界刺激條件下蒜氨酸在蒜氨酸酶作用下轉(zhuǎn)化為蒜素的動態(tài)代謝過程，拓展了大氣壓質(zhì)譜分析技術(shù)的具體應(yīng)用范圍。然而，iEESIMS主要用于分析凝聚態(tài)軟質(zhì)固體樣品。最近，本課題組Shen等[27]在電噴霧電離（ESI）的基礎(chǔ)上設(shè)計了單粒電噴霧電離質(zhì)譜（SGESI）技術(shù)，可以用來分析硬質(zhì)固體樣本，半定量分析了單粒水稻中的脂肪酸含量和有機(jī)農(nóng)藥等，檢出限（LODs）為0.11～1.30 ng/g，區(qū)別了不同產(chǎn)地和儲存時間水稻間的差異性，用于水稻的品質(zhì)評價。

2.3組織大氣壓質(zhì)譜成像分析

質(zhì)譜成像是指將質(zhì)譜技術(shù)和圖像處理軟件相結(jié)合的一種新型分子成像技術(shù)，能夠直觀提供樣品中分子空間分布信息[28]。相比于傳統(tǒng)的成像技術(shù)，大氣壓質(zhì)譜成像無需熒光及同位素標(biāo)記，能夠保證樣品原始的形態(tài)和特征無損，從而獲取組織切片中的關(guān)鍵物質(zhì)分布信息。同時，與二次離子質(zhì)譜（SIMS）和基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜（MALDIMS）成像技術(shù)相比，大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)不需要在高真空條件下進(jìn)行測定，也不需要額外的基質(zhì)輔助，可以進(jìn)行實(shí)時原位分析，彌補(bǔ)了空間分析能力的局限性。

如前所述，植物中存在的天然活性成分，很多具有重要的生物學(xué)功能，研究其功能需了解這些物質(zhì)在組織中的具體分布，大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)可以原位對組織中的物質(zhì)分布實(shí)現(xiàn)可視化。例如，Enomoto等[29]采用DESIMSI分析未成熟菜豆種子中的脫落酸（ABA）和12氧植物二烯酸（OPDA）的分布情況，利用大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了植物激素可視化分析。盡管成像技術(shù)彌補(bǔ)了AMS在空間可視化的缺陷，但是目前大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)還尚未完全成熟，仍需提升空間分辨率和檢測靈敏度等。激光剝蝕技術(shù)結(jié)合大氣壓離子源，具有較高空間分辨率且可以成像不規(guī)則表面，因其可以穿透組織細(xì)胞壁、角質(zhì)層等表面而被廣泛應(yīng)用[30]。最近，F(xiàn)owble等[31]基于DART開發(fā)了激光剝蝕實(shí)時在線分析（LADIMS）技術(shù)，首次分析了罌粟、木曼陀羅等中阿托品和東莨菪堿等物質(zhì)合成過程中精氨酸、托品酮等的分布情況。Stopka等[32]在激光剝蝕電噴霧電離成像（LAESIMSI）技術(shù)上結(jié)合21特斯拉傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（21TFTICR），提高了分辨率，監(jiān)測了葉片組織葉綠素a的同位素結(jié)構(gòu)信息及其分布情況，為識別同位素分子提供了新的平臺。Moreno等[33]在LTPMSI系統(tǒng)上安裝了激光解吸（LD），對仙人掌中的麥司卡林、曼陀羅種子中的阿托品及煙草幼苗中的尼古丁等空間分布情況進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明，生物堿可能主要富集在害蟲出現(xiàn)的區(qū)域，揭示了植物防御中的生物學(xué)功能。

3動物組織分析

大氣壓質(zhì)譜結(jié)合成像技術(shù)用于動物組織分析主要包括監(jiān)測動物組織中內(nèi)源性物質(zhì)及外源性物質(zhì)，具體在病理研究、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測和食品安全等領(lǐng)域研究頗多。

3.1內(nèi)源性物質(zhì)分析

目前，對動物組織中的內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行分析常涉及病理研究，實(shí)時檢測生物體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的動力學(xué)特征是分析檢測和生物領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一[34]。大氣壓質(zhì)譜為活體生物分析提供了可能，能夠在活體內(nèi)原位檢測內(nèi)源性物質(zhì)。例如，Zaitsu等[35]采用探針電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（PESIMS/MS）實(shí)時分析了注入1型大麻素受體（CB1R）后小鼠腦組織中能量代謝物的動力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)CB1R會破壞大腦腦組織中的能量代謝過程。通常，大腦組織具有區(qū)域功能，因此， 對不同區(qū)域的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究是必要的。Hayashi等[36]采用PESIMS/MS直接分析了小鼠大腦海馬區(qū)和額葉皮中25種代謝產(chǎn)物，MS/MS提高了檢測的靈敏度，運(yùn)用PCA很好地區(qū)別了海馬區(qū)和額葉皮組織，同時揭示了額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)組織代謝水平的差異性，為病理研究提供全面有效的參考價值。近年來，越來越多的研究表明生物體內(nèi)的脂質(zhì)常常和某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如阿爾茲海默癥病、糖尿病及癌癥等[37]。利用大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)，根據(jù)生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的含量和分布，進(jìn)一步推測代謝途徑及病理關(guān)系。Bergholt等[38]運(yùn)用 DESIMSI分析了大鼠腦組織中的脂質(zhì)和多發(fā)性硬化癥的關(guān)系，首次表明多發(fā)性硬化癥中的再生髓鞘和正常髓鞘中的磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的差異性。Wang等[39]將三氟乙酸作為添加劑提高DESIMS檢測腦組織中膽固醇和其它代謝產(chǎn)物的靈敏度，發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥病（AD）小鼠腦組織切片中膽固醇含量相對偏高。結(jié)合成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)小腦、脊髓、髓質(zhì)等區(qū)域的膽固醇含量增加，還發(fā)現(xiàn)大腦不同區(qū)域的天冬氨酸、谷氨酸及次黃嘌呤等分布的差異性， 揭示其在神經(jīng)學(xué)科等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，為尋找AD潛在生物標(biāo)記物提供了有價值的信息。Yin等[40]等運(yùn)用納米解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（nanoDESIMSI）技術(shù)對小鼠胰島中的PC、鞘磷脂（SM）、磷脂酰肌醇（PI）等脂質(zhì)進(jìn)行空間定位，分辨率可以達(dá)到11 μm，發(fā)現(xiàn)胰島和其周圍組織中的脂質(zhì)存在差異性，這可能與胰島素的分泌過程有關(guān)，有望揭示疾病發(fā)生的基本機(jī)制。然而， 脂質(zhì)物質(zhì)包含著大量的同分異構(gòu)體，不同結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮不同的作用[41]。近年來，對不飽和脂質(zhì)異構(gòu)體中雙鍵位置進(jìn)行研究成為脂質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)。例如，Tang等[42]利用液相微臨界表面取樣探針質(zhì)譜（LMJSSPMS）耦合PaternòBüchi（PB）光反應(yīng)分析正常小鼠乳腺組織和乳腺癌小鼠中不飽脂質(zhì)位置異構(gòu)體的差異性，結(jié)合MS/MS研究發(fā)現(xiàn)，磷脂（PC16∶0/18∶1）位置異構(gòu)體中（9Z）/（11Z）含量的比值明顯存在差異。最近，Waldchen等[43]運(yùn)用基質(zhì)MALDIMSI耦合PB光反應(yīng)，用二苯甲酮作為新型反應(yīng)基質(zhì)，分析了小鼠腦組織白質(zhì)和灰質(zhì)中不飽和脂質(zhì)位置異構(gòu)體分布的差異性。然而，目前利用大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)分析組織中脂質(zhì)異構(gòu)體的分布相關(guān)研究甚少，此方法的進(jìn)一步發(fā)展將會成為很有前途的脂質(zhì)組學(xué)研究手段。

基于質(zhì)譜的疾病蛋白組學(xué)研究也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，通過尋找疾病特應(yīng)性蛋白可以為藥物設(shè)計提供豐富的靶點(diǎn)，在新藥物開發(fā)中具有重要意義。但是，蛋白質(zhì)等大分子很難從樣品中解吸，同時也受到小分子物質(zhì)的抑制作用，因此直接在生物樣品上鑒定蛋白質(zhì)等大分子信息仍然具有挑戰(zhàn)性[44]。目前，MALDIMSI在組織切上可以得到單電荷蛋白質(zhì)大分子的空間部分情況，但是其需要另外的基質(zhì)輔助，具有一定的局限性。大氣壓質(zhì)譜成像可以直接對生物樣品上的大分子蛋白成像，而且可以檢測多電荷的離子，擴(kuò)大了分析范圍。 例如，F(xiàn)eider等[45]將LMJSSP和高場不對稱波形離子遷移譜（FAIMS）結(jié)合對大鼠腦組織進(jìn)行二維（2D）成像，F(xiàn)AIMS可以明顯增強(qiáng)生物組織中的多電荷蛋白成像能力，可視化大鼠腦組織中的84種多電荷蛋白質(zhì)，圖像清楚地顯示了大鼠腦白質(zhì)中含有更多的蛋白質(zhì)（圖2）。Hsu等[46]無需胰蛋白酶前期處理，將顯微鏡和nanoDESIMS結(jié)合自上而下分析了成年水蛭神經(jīng)節(jié)中的多電荷神經(jīng)血紅蛋白，同時結(jié)合肽序列標(biāo)簽法確定了編碼多肽的基因。

近年來，仿生材料已成為材料科學(xué)與工程發(fā)展的重要研究方向之一，且仿生材料的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域就是生物醫(yī)用材料[47]。自然界中生物的表面具有特殊性質(zhì)，對材料科學(xué)領(lǐng)域提供了新的思路，因此對其進(jìn)行直接分析十分必要。Roman等[48]運(yùn)用LAESIMSI對干燥、薄的生物樣品表面直接分析成像，鑒別了蟬的翅膀中烴類、脂質(zhì)、酯類、胺類、酰胺類等化合物的分布情況， 用于闡明天然生物材料的物理結(jié)構(gòu)化學(xué)成分生物功能間的關(guān)系，為研究功能生物材料奠定了一定的基礎(chǔ)（圖3A）。

3.2外源性物質(zhì)分析

3.2.1藥物研究及環(huán)境監(jiān)測藥物研發(fā)過程中，了解藥物在動物組織的靶向分布及原位信息對于藥物吸收、代謝等情況具有重要意義，同時對藥效動力學(xué)及毒理學(xué)評價等研究也具有指導(dǎo)作用，大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)為其提供了技術(shù)支撐[49]。例如，Xu等[50]采用液相萃取表面串聯(lián)質(zhì)譜分析（LESAMS/MS）分析了羅替戈汀在大鼠腦組織不同區(qū)域的分布情況，最低定量限（LLOQ）為0.05 ng/mL，結(jié)合成像技術(shù)表明羅替戈汀分布在大腦中的海馬區(qū)和紋狀體區(qū)域。此外，Burns等[51]采用LMJSSPMS非靶向快速篩選和鑒定了牛肝、豬腎、馬脾、馬腎中的氟尼辛、替米考星、氯胺酮、戊巴比妥等的殘留情況，用以獸醫(yī)毒理學(xué)診斷。當(dāng)今環(huán)境問題日益嚴(yán)峻，大氣壓質(zhì)譜分析還可通過檢測動物組織中積累的有毒化合物來監(jiān)測環(huán)境污染程度。Perez等[52]運(yùn)用DESIMSI首次報道了毒性液體季銨鹽離子液體（AMMOENG 130）在斑馬魚全身的分布和代謝情況，用來監(jiān)測環(huán)境中的污染物，為研究小型水生生物的生態(tài)毒理學(xué)開辟新的途徑（圖3C）。

3.2.2食品安全分析當(dāng)今，人們對食品的安全及品質(zhì)要求越來越高，大氣壓質(zhì)譜技術(shù)為食品安全提供了有效可行的手段，在原位監(jiān)測食品安全和質(zhì)量等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。Chakrabarty等[53]基于大氣固體分析探針（ASAPMS）技術(shù)和改良電噴霧電離質(zhì)譜（MDESIMS）技術(shù)快速半定量分析了羊肉切片中齊帕特羅的含量，結(jié)果表明， ASAP檢測的LOD為0.4～1.0 ng/g，LOQ為0.4～1.2 ng/g，MDESI的LOD為0.2～0.6 ng/g，LOQ為0.5～2.1 ng/g，體現(xiàn)了其在食品安全質(zhì)控方面的潛在應(yīng)用價值。盧海艷等[54]運(yùn)用iEESIMS技術(shù)定性檢測了豬肉中的克倫特羅和丙卡特羅，Xu等[55]定量分析了豬肉中6種瘦肉精的含量，線性檢測范圍0.01～1000 ug/kg（R2>0.9994），LOD為2 ng/kg（圖3B）。另外，Lu等[56]直接從分子水平研究了克倫特羅和沙丁胺醇代謝對豬肉品質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿的含量與豬肉品質(zhì)密切相關(guān)。

4臨床術(shù)后組織分析

當(dāng)前， 在中國，80%的疾病死亡率是由癌癥引起的[57]?；诖髿鈮嘿|(zhì)譜成像分析的性能優(yōu)勢，目前已應(yīng)用到臨床術(shù)后多種癌癥類型組織的研究中（如腦膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸癌、皮膚癌等），利用其對組織進(jìn)行原位代謝、蛋白組學(xué)等的研究，進(jìn)而更全面、高通量地表征腫瘤微區(qū)域環(huán)境代謝等的變化，為在臨床上對腫瘤邊緣進(jìn)行評估、潛在標(biāo)志物的尋找、研究腫瘤代謝機(jī)制、靶向腫瘤藥物研制等提供新的視角，作為癌癥診斷的潛在臨床新方法，大氣壓質(zhì)譜成像技術(shù)為其診斷提供了廣闊前景[58，59]。

4.1體外分析

當(dāng)前，臨床術(shù)中邊緣評估操作流程繁瑣，需要冷凍切片、染色和顯微鏡觀察，而且只能在形態(tài)上識別癌癥邊緣，難免存在人為誤判斷的潛在風(fēng)險，也無法提供分子水平的信息。常規(guī)的質(zhì)譜技術(shù)（LCMS）處理組織樣本不僅費(fèi)時，而且處理后的樣本無法再進(jìn)行后續(xù)的組織學(xué)研究。AMS技術(shù)能對新鮮或冷凍的組織樣品進(jìn)行原位分析，保留了樣品的關(guān)鍵特征的同時還可進(jìn)行后續(xù)的組織學(xué)研究[60]。 Pirro等[61]在手術(shù)室中僅用3 min，直接對腦膠質(zhì)瘤新鮮組織切片進(jìn)行了邊緣評估，無需冷藏切片，直接分析了樣本中的脂質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)， DESIMS具有93%的敏感性和83%的特異性。Ashizawa等[62]建立了一種快速準(zhǔn)確的術(shù)中評估方法（該過程僅需約5 min），運(yùn)用PESIMS識別頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤邊緣，結(jié)合偏最小二乘回歸（PLS）統(tǒng)計學(xué)方法和邏輯回歸分類（LR）模型算法，在正離子和負(fù)離子模式下，該方法的準(zhǔn)確率分別為臨床病理診斷的90.48%和95.35%。目前，小型質(zhì)譜儀也運(yùn)用到疾病診斷中。Zou等[63]將納升電噴霧電離（nanoESI）和Mini 12小型質(zhì)譜結(jié)合，實(shí)時檢測了腦膠質(zhì)瘤活檢組織樣品中的2羥基戊二酸（2HG），充分展現(xiàn)其在醫(yī)療檢測領(lǐng)域的巨大潛力。然而，小型質(zhì)譜儀的靈敏度和特異性不高，對組織樣品直接進(jìn)行鑒定具有一定的局限性。

腫瘤細(xì)胞通過代謝重新編程以適應(yīng)其惡性增殖，是區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特征[64]。因此癌變組織與健康組織間存在復(fù)雜的代謝差異，大氣壓質(zhì)譜成像可以量化這些化學(xué)差異，是在分子水平上對腫瘤組織可視化的有力工具，從樣品上挖掘出更多的信息，獲取待測分子間的空間關(guān)系，對腫瘤代謝進(jìn)行深入表征， 能夠?yàn)檠芯科浒l(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)潛在診療靶點(diǎn)提供新的契機(jī)。例如，Margulis等[65]采用DESIMS對微米級別的基底細(xì)胞瘤（BCC）中的脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物進(jìn)行二維（2D）成像，并采用最小絕對收縮和選擇算子（Lasso）對健康皮膚組織和BCC進(jìn)行了區(qū)別。Zhang等[66]運(yùn)用DESIMS對甲狀腺組織進(jìn)行2D成像，發(fā)現(xiàn)心磷脂在癌變組織中含量相對較高，可以作為潛在的生物標(biāo)志物。Sun等[67]提出了“下游代謝物關(guān)聯(lián)上游代謝酶”的腫瘤代謝表征策略，利用空氣動力輔助解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（AFADESIMSI）技術(shù)在空間上對256例食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）患者組織中的各種代謝途徑進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了與代謝途徑改變密切相關(guān)的異常表達(dá)的代謝酶，它們廣泛參與ESCC的癌變過程，首次發(fā)現(xiàn)PYCR2和UPase1在ESCC組織中差異表達(dá)（圖4A）。Banerjee等[68]運(yùn)用DESIMS結(jié)合成像技術(shù)分析了54例前列腺正常和癌變組織中的小分子脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物差異性，同時監(jiān)測了三羧酸循環(huán)過程的中間體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，利用癌變組織中葡萄糖和檸檬酸根離子強(qiáng)度的比值可以區(qū)分前列腺癌變組織與正常組織（圖4B）。

此外，直接對組織的天然蛋白進(jìn)行成像是目前研究的重點(diǎn)，同時也是所面臨的挑戰(zhàn)之一，尋找特異性蛋白對于臨床上診斷癌癥有著重要的意義。例如，F(xiàn)eider等[45]采用LMJSSPFAMSIMS對高級別漿液性卵巢癌（HGSC）組織中的蛋白質(zhì)（泛素、胸腺素β4、血紅蛋白、鈣周期蛋白）進(jìn)行2D成像，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域的泛素、胸腺素β4及鈣周期蛋白等相對含量多，這是首次在人類癌癥組織進(jìn)行蛋白成像的研究。之后，Garza等[69]采用DESIFAMSIMS結(jié)合紫外光解離（UVPD）和碰撞誘導(dǎo)解離（CID）自上而下鑒定了乳腺組織中的16種蛋白質(zhì)，分析了Her2導(dǎo)管乳腺癌和正常組織，發(fā)現(xiàn)正常組織中的前纖維蛋白1和血紅蛋白α等相對含量較高，而S100蛋白在腫瘤組織含量較高（圖4C）。目前，大部分成像技術(shù)還是基于2D成像，如果能夠在三維（3D）空間內(nèi)對腫瘤中化學(xué)成分進(jìn)行描述，就有可能對其生物組成、相互作用和異質(zhì)性原因做出解釋。例如，Inglese等[70]運(yùn)用DESIMS結(jié)合成像技術(shù)分析直腸癌組織，將其得到的2D代謝產(chǎn)物圖像進(jìn)行3D重建，對研究腫瘤異質(zhì)性、研發(fā)腫瘤靶向藥物及個體化腫瘤治療具有重要意義。

4.2體內(nèi)分析

大氣壓質(zhì)譜在臨床上潛在的應(yīng)用須使其在術(shù)中發(fā)揮作用，運(yùn)用到體內(nèi)分析，進(jìn)而實(shí)時診斷，而大氣壓質(zhì)譜離子源的不斷開發(fā)是非常必要的。目前，iKnife、SpiderMass及MasSpec Pen等方法有望用于體內(nèi)實(shí)時診斷。iKnife 是目前開發(fā)的第一個手持式質(zhì)譜分析儀，其能夠通過外科設(shè)備產(chǎn)生的熱進(jìn)而誘導(dǎo)樣品分子氣化和電離，進(jìn)而對手術(shù)過程中產(chǎn)生的煙霧實(shí)時分析，能幫助外科醫(yī)生切除更多的癌變組織，同時還可以降低對腫瘤周邊組織的傷害，用于體內(nèi)癌癥診斷[71]。例如，John等[72]采用REIMS分析了正常乳腺和癌變?nèi)橄俳M織中脂質(zhì)代謝化合物的不同，研究發(fā)現(xiàn)， 癌癥組織中的磷脂（m/z 600～850）物質(zhì)含量較高，甘油三酸脂（m/z 850～1000）的含量相對較低，同時提出了體內(nèi)實(shí)時評估腫瘤邊緣的概念模型，具有提升術(shù)中腫瘤邊緣評估的精準(zhǔn)率的潛在能力。Alexander等[73]開發(fā)了一種內(nèi)窺鏡REIMS，實(shí)時分析了大腸癌中的脂質(zhì)信息，并提出了該裝置在術(shù)中對5名患者進(jìn)行體內(nèi)分析的可行性。Phelps等[7]預(yù)先使用冷凍的卵巢組織建立模型，然后再用新鮮組織進(jìn)行驗(yàn)證。運(yùn)用REIMS對良性卵巢組織、交界性腫瘤和癌組織診斷的敏感性分別為87.0%、71.4%和87.2%，一定程度上說明了REIMS作為術(shù)中卵巢癌診斷的可行性（圖5A）。與iKnife分析系統(tǒng)不同，SpiderMass的主要優(yōu)勢是侵入性較小，所需要的組織樣本量僅為0.1～0.3 mm3。Fatou等[8]運(yùn)用SpiderMass系統(tǒng)體外對正常卵巢組織和卵巢癌組織進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)癌變組織中磷脂的相對豐度很高，具有在術(shù)中評估腫瘤邊緣的潛在能力。此外，利用其在體內(nèi)對手指表面的皮膚組織與損傷組織進(jìn)行了分析，說明SpiderMass能夠在微創(chuàng)條件下進(jìn)行體內(nèi)實(shí)時分析（圖5B）。Zhang等[9]運(yùn)用MasSpec Pen離體分析253個組織樣本，包括正常和癌變的肺、卵巢、甲狀腺及乳腺組織，能夠在短時間（幾秒鐘）區(qū)分癌變組織和正常組織，是目前病理診斷手段所需時間的1/150（圖5C）。

5總結(jié)和展望

本文主要對大氣壓質(zhì)譜分析技術(shù)在植物、動物和臨床術(shù)后組織方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，結(jié)合成像技術(shù)開展大量與組織樣本相關(guān)的研究工作，主要應(yīng)用集中在藥物研發(fā)、疾病診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。然而，大氣壓質(zhì)譜和成像技術(shù)在某些方面還面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，例如，對沒有預(yù)處理的組織樣本直接定量分析是當(dāng)前亟需解決的問題。在定性分析的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量依然是核心研究領(lǐng)域。 今后，大氣壓質(zhì)譜技術(shù)完全運(yùn)用到臨床癌癥診斷中，必需解決如何定量的問題，精確判定“量變到質(zhì)變”的分子界限; 其次，儀器分析的靈敏度、分辨率等需要進(jìn)一步提高。圍繞這些挑戰(zhàn)，大氣壓質(zhì)譜和成像技術(shù)在當(dāng)前需要重點(diǎn)研究的內(nèi)容包括以下幾個方面： 首先，需進(jìn)一步開發(fā)新型的大氣壓質(zhì)譜電離平臺以及小型化的質(zhì)譜儀，尤其能夠?qū)崿F(xiàn)采樣過程自動化，靈敏地對組織中的各類物質(zhì)進(jìn)行有效電離并且檢測的質(zhì)譜儀，同時向小型、便攜、簡單的方向發(fā)展，對現(xiàn)場實(shí)現(xiàn)真正的原位分析，尤其在臨床疾病診斷中，使其能夠適用于體內(nèi)分析; 其次，大氣壓質(zhì)譜成像作為新型的質(zhì)譜成像技術(shù)，需進(jìn)一步提高成像的空間分辨率、靈敏度及自動化程度等; 再者，有必要開發(fā)更有效的軟件和統(tǒng)計方法，更好地解釋成像數(shù)據(jù)，結(jié)合目前計算機(jī)科學(xué)領(lǐng)域中的人工智能，對質(zhì)譜成像圖像進(jìn)行更智能地解釋。因此，推動大氣壓質(zhì)譜新型離子化技術(shù)、精準(zhǔn)分析、質(zhì)譜成像及儀器小型智能化仍是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

References

1LU HaiYan， ZHANG Hua， XIAO YiPo， LI Yi， GU HaiWei， CHEN HuanWen. J. Instrum. Anal.，? 2017， 36（2）： 152-160

盧海艷， 張 華， 肖義坡， 李 毅， 顧海巍， 陳煥文. 分析測試學(xué)報，? 2017，? 36（2）： 152-160

2Hsu C C， Dorrestein P C. ? Curr. Opin. Biotechnol.，? 2015，? 31： 24-34

3Margulis K， Zhou Z P， Fang Q Z， Sievers R E， Lee R J， Zare R N. Anal. Chem.，? 2018，? 90（20）： 12198-12206

4He J M， Sun C L， Li T G， Luo Z G， Huang L J， Song X W， Li X， Abliz Z. Adv. Sci.，? 2018，? 5（11）： 1800250

5Yue H， Ma L， Pi Z F， Chen H W， Wang Y， Hu B， Liu S Y. Planta Med.，? 2013，? 79（2）： 169-174

6Gross J H. Anal. Bioanal. Chem.，? 2014，? 406（1）： 63-80

7Phelps D L， Balog J， Gildea L F， Bodai Z， Savage A， ElBahrawy M A， Speller A V M， Rosini F， Kudo H， McKenzie J S， Brown R， Takats Z， GhaemMaghami S. Brit. J. Cancer，? 2018，? 118（10）： 1349-1358

8Fatou B， Saudemont P， Leblanc E， Vinatier D， Mesdag V， Wisztorski M， Focsa C， Salzet M， Ziskind M， Fournier I. ? Sci. Rep.，? 2016，? 6： 25919

9Zhang J L， Rector J， Lin J Q， Young J H， Sans M， Katta N， Giese N， Yu W D， Nagi C， Suliburk J， Liu J S， Bensussan A， DeHoog R J， Garza K Y， Ludolph B， Sorace A G， Syed A， Zahedivash A， Milner T E， Eberlin L S. Sci. Transl. Med.，? 2017，? 9（406）： eaan3968

10Wu C P， Dill A L， Eberlin L S， Cooks R G， Ifa D R. Mass Spectrom. Rev.，? 2013，? 32（3）： 218-243

11Huang M Z， Yuan C H， Cheng S C， Cho Y T， Shiea J. Annu. Rev. Anal. Chem.，? 2010，? 3： 43-65

12Weston D J. Analyst，? 2010，? 135（4）： 661-668

13Huang M Z， Cheng S C， Cho Y T， Shiea J. Anal. Chim. Acta，? 2011，? 702（1）： 1-15

14Klejdus B， Kovacik J. Ind. Crop. Prod.，? 2016，? 83： 774-780

15Rocca L M， Cecca J， L'Episcopo N， Fabrizi G. J. Mass Spectrom.，? 2017，? 52（11）： 709-719

16Schilmiller A L， Last R L， Pichersky E. Plant J.，? 2008，? 54（4）： 702-711

17Freund D M， Martin A C， Cohen J D， Hegeman A D. Planta，? 2018，? 247（1）： 267-275

18Prchalova J， Kovarik F， Rajchl A. J. Mass Spectrom.，? 2017，? 52（2）： 116-126

19Shiea J， Huang M Z， Hsu H J， Lee C Y， Yuan C H， Beech I， Sunner J. Rapid Commun. Mass Spectrom.，? 2005，? 19（24）： 3701-3704

20Bierstedt A， Riedel J. ? Methods，? 2016，? 104： 3-10

21MartinezJarquin S， HerreraUbaldo H， de Folter S， Winkler R. Talanta，? 2018，? 185： 324-327

22He T Y， Chambers M I， Musah R A. Anal. Chem.，? 2018，? 90（21）： 12802-12809

23Zhang H， Gu H W， Yan F Y， Wang N A， Wei Y P， Xu J J， Chen H W. Sci. Rep.，? 2013，? 3： 2495

24Xu J Q， Chen H W. Bioanalysis，2018，? 10（8）： 523-525

25Zhang H， Bibi A S， Lu H Y， Han J， Chen H W. J. Mass Spectrom.，2017，? 52（8）： 526-533

26Zhang H， Chingin K， Zhu L， Chen H W. Anal. Chem.，? 2015，? 87（5）： 2878-2883

27Shen S S， Zhang H， Huang K K， Chen H W， Shen W X， Fang X W. New J. Chem.，? 2019，? 43（5）： 2118-2125

28Boughton B A， Thinagaran D， Sarabia D， Bacic A， Roessner U. ? Phytochem. Rev.，? 2016，? 15（3）： 445-488

29Enomoto H， Sensu T， Sato K， Sato F， Paxton T， Yumoto E， Miyamoto K， Asahina M， Yokota T， Yamane H. Sci. Rep.，? 2017，? 7： 42977

30Bong Y， Li B， Malitsky S， Rogachev L， Aharoni A， Kaftan F， Svatos A， Franceshi P. Front. Plant Sci.，? 2016， 7： 60

31Fowble K L， Teramoto K， Cody R B， Edwards D， Guarrera D， Musah R A. Anal. Chem.，2017，? 89（6）： 3421-3429

32Stopka S A， Samarah L Z， Shaw J B， Liyu A V， Velickovic D， Agtuca B J， Kukolj C， Koppenaal D W， Stacey G， PasaTolic L， Anderton C R， Vertes A. Anal. Chem.，? 2019，? 91（8）： 5028-5035

33MorenoPedraza A， RosasRoman I， GarciaRojas N S， GuillenAlonso H， OvandoVazquez C， DiazRamirez D， CuevasContreras J， Vergara F， MarschMartinez N， MolinaTorres J， Winkler R. ? Anal. Chem.，? 2019，? 91（4）： 2734-2743

34Jeong S， Eskandari R， Park S M， Alvarez J， Tee S S， Weissleder R， Kharas M G， Lee H， Keshari K R. Sci. Adv.，2017，? 3（6）： e1700341

35Zaitsu K， Hayashi Y， Murata T， Yokota K， Ohara T， Kusano M， Tsuchihashi H， Ishikawa T， Ishii A， Ogata K， Tanihata H. ? Anal. Chem.，? 2018，? 90（7）： 4695-4701

36Hayashi Y， Zaitsu K， Murata T， Ohara T， Moreau S， Kusano M， Tanihata H， Tsuchihashi H， Ishii A， Ishikawa T. Anal. Chim. Acta，2017，? 983： 160-165

37Harayama T， Riezman H. ? Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， ?2018，? 19（5）： 281-296

38Bergholt M S， Serio A， McKenzie J S， Boyd A， Soares R F， Tillner J， Chiappini C， Wu V， Dannhorn A， Takats Z， Williams A， Stevens M M. ACS Central Sci.，? 2018，? 4（1）： 39-51

39Wang X Q， Hou Y W， Hou Z H， Xiong W， Huang G M. Anal.Chem.，2019，? 91（4）： 2719-2726

40Yin R C， Kyle J， BurnumJohnson K， Bloodsworth K J， Sussel L， Ansong C， Laskin J. Anal. Chem.，? 2018，? 90（11）： 6548-6555

41Ma X X， Xia Y. Angew. Chem.Int. Edit.，? 2014，? 53（10）： 2592-2596

42Tang F， Guo C G， Ma X X， Zhang J， Su Y， Tian R， Shi R Y， Xia Y， Wang X H， Ouyang Z. Anal. Chem.，2018，? 90（9）： 5612-5619

43Waldchen F， Spengler B， Heiles S. ? J. Am. Chem. Soc.，? 2019，? 141（30）： 11816-11820

44Douglass K A， Venter A R. J. Mass Spectrom.，? 2013，? 48（5）： 553-560

45Feider C L， Elizondo N， Eberlin L S. Anal. Chem.，? 2016，? 88（23）： 11533-11541

46Hsu C C， Baker M W， Gaasterland T， Meehan M J， Macagno E R， Dorrestein P C. Anal. Chem.，? 2017， 89（16）： 8251-8258

47Shin H， Jo S， Mikos A G. Biomaterials，? 2003，? 24（24）： 4353-4364

48Roman J K， Walsh C M， Oh J， Dana C E， Hong S， Jo K D， Alleyne M， Miljkovic N， Cropek D M. Anal. Bioanal. Chem.，? 2018，? 410（7）： 1911-1921

49Willmann J K， van Bruggen N， Dinkelborg L M， Gambhir S S. Nat. Rev. Drug Discov.，? 2008，? 7（7）： 591-607

50Xu L X， Wang T T， Geng Y Y， Wang W Y， Li Y， Duan X K， Xu B， Liu C C， Liu W H. Anal. Bioanal. Chem.，? 2017，? 409（22）： 5217-5223

51Burns L E， Borts D J. Anal. Chim. Acta，? 2019，? 1063： 75-81

52Perez C J， Tata A， de Campos M L， Peng C， Ifa D R. ? J. Am. Soc. Mass Spectrom.，? 2017，? 28（6）： 1136-1148

53Chakrabarty S， Shelver W L， Hakk H， Smith D J. ? J. Agric. Food Chem.，? 2018，? 66（41）： 10871-10880

54LU HaiYan， ZHANG Hua， ZHOU Wei， CHEN HuanWen. Mod. Food Technol.，? 2016，? 32（06）： 298303

盧海艷， 張 華， 周 煒， 陳煥文. 現(xiàn)代食品科技，? 2016，? 32（06）： 298-303

55Xu J Q， Xu S R， Xiao Y P， Chingin K， Lu H Y， Yan R H， Chen H W. Anal. Chem.，? 2017，? 89（21）： 11252-11258

56Lu H Y， Zhang H， Zhu T G， Xiao Y P， Xie S X， Gu H W， Cui M， Luo L P. Sci. Rep.，? 2017，? 7： 5136

57Chen W Q， Sun K X， Zheng R S， Zeng H M， Zhang S W， Xia C F， Yang Z X， Li H， Zou X N， He J. Chin. J. Cancer Res.，? 2018，? 30（1）： 1-12

58Zhang J L， Yu W D， Suliburk J， Eberlin L S. ? Clin. Chem.，? 2016，? 62（9）： 1172-1174

59Banerjee S. J. Biosci.，? 2018，? 43（4）： 731-738

60Ferreira C R， Yanne K E， Jarmusch A K， Pirro V， Ouyang Z， Cooks R G. ? Clin. Chem.，? 2016，? 62（1）： 99-110

61 Pirro V， Alfaro C M， Jarmusch A K， Hattab E M， CohenGadol A A， Cooks R G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2017，? 114（26）： 6700-6705

62Ashizawa K， Yoshimura K， Johno H， Inoue T， Katoh R， Funayama S， Sakamoto K， Takeda S， Masuyama K， Matsuoka T， Ishii H. Oral Oncol.，? 2017，? 75： 111-119

63Zou R， Cao W B， Chon L， Hua W， Xu H， Mao Y， Page J， Shi R Y， Xia Y， Hu T Y， Zhang W P， Ouyang Z. ? Anal. Chem.，? 2019，? 91（1）： 1157-1163

64Lu J R， Tan M， Cai Q S. ? Cancer Lett.， ?2015， ?356（2）： 156-164

65Margulis K， Chiou A S， Aasi S Z， Tibshirani R J， Tang J Y， Zare R N. ? Proc. Natl. Acad. Sci. USA，? 2018，? 115（25）： 6347-6352

66Zhang J L，Yu W D， Ryu S W， Lin J， Buentello G， Tibshirani R， Suliburk J， Eberlin L S. Cancer Res.，2016，? 76（22）： 6588-6597

67Sun C L， Li T G， Song X W， Huang L J， Zang Q C， Xu J， Bi N， Jiao G G， Hao Y Z， Chen Y H， Zhang R P， Luo Z G， Li X， Wang L H， Wang Z H， Song Y M， He J M， Abliz Z. ? Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2019，? 116（1）： 52-57

68Banerjee S， Zare R N， Tibshirani R J， Kunder C A， Nolley R， Fan R， Brooks J D， Sonn G A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，? 2017，? 114（13）： 3334-3339

69Garza K Y， Feider C L， Klein D R， Rosenberg J A， Brodbelt J S， Eberlin L S. Anal. Chem.，? 2018，? 90（13）： 7785-7789

70Inglese P， McKenzie J S， Mroz A， Kinross J， Veselkov K， Holmes E， Takats Z， Nicholson J K， Glen R C. Chem. Sci.，2017，? 8（5）： 3500-3511

71Schaefer K C， Denes J， Albrecht K， Szaniszlo T， Balog J， Skoumal R， Katona M， Toth M， Balogh L， Takats Z. Angew. Chem. Int. Edit.，? 2009，? 48（44）： 8240-8242

72John E R， Balog J， McKenzie J S， Rossi M， Covington A， Muirhead L， Bodai Z， Rosini F， Speller A V M， Shousha S， Ramakrishnan R， Darzi A， Takats Z， Leff D R. Breast Cancer Res.，2017，? 19： 59

73Alexander J， Gildea L， Balog J， Spelle A， McKenzie J， Muirhead L， Scott A， Kontovounisios C， Rasheed S， Teare J， Hoare J， Veselkov K， Goldin R， Tekkis P， Darzi A， Nicholson J， Kinross J， Takats Z. Surg. Endosc.，? 2017，? 31（3）： 1361-1370