基于不同鏈長DNA金納米粒子的陣列比色傳感器對多種重金屬離子的鑒別

邊孟孟 徐夢 袁亞利 聶瑾芳

摘要構建了一種基于DNA金納米粒子（DNAAuNPs）的無標記比色陣列傳感器，用于多種金屬離子的鑒別。以不同長度單鏈DNA（ssDNA）鏈（15A、 30A和45AT）作為非特異性受體，分別與AuNPs結合，構成3個復合體系（15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs、45AT DNAAuNPs），作為此傳感器的3個陣列傳感元件。在高濃度鹽的存在下，不同的金屬離子可觸發(fā)DNA保護的AuNPs顯示出不同的聚集行為并呈現各種顏色變化。以紫外可見吸收光譜作為傳感器的響應信號，通過主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）對此比色傳感器的響應信號進行分析。實驗結果表明， 11種不同重金屬離子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）在0.5 μmol/L水平下，通過LDA可得到很好的區(qū)分。

關鍵詞DNA金納米粒子; 化學計量學; 多維比色傳感器; 重金屬離子

1引 言

近年來，由于人類活動導致的鉛、汞、鋅、銅、鐵等各種重金屬[1]的過度使用及排放日益加劇，通過空氣、水、食物等方式進入人體，并在體內積累[2]。雖然微量重金屬元素可調節(jié)機體內的生物酶活性，增進宏量元素在體內的傳輸[3]，但過量重金屬可抑制酶的活性，破壞正常的生物化學反應，產生遺傳毒性、生殖毒性等，極大地影響人類健康和社會可持續(xù)發(fā)展[4～6]。重金屬離子通常以混合物的形式存在于環(huán)境中，已有研究表明，當多種重金屬離子同時存在時， 常表現出協同毒性[7]。因此，對于多種重金屬離子同時檢測具有重要的意義。

目前，檢測重金屬離子的傳統(tǒng)方法包括原子熒光光譜法（AFS）[8]、原子發(fā)射光譜法（AAS）[9]、電感耦合等離子體質譜法（ICPMS）[10]等，分析的準確度、精密度和靈敏度均可達到國家標準檢測要求，而且可實現重金屬離子的同時檢測。然而，傳統(tǒng)的檢測技術從采樣到檢測的全程耗時較長，檢測多使用大型設備，成本較高，難以實現現場定量或定性分析。

近年來，多維傳感器在檢測重金屬方面取得較大進展[11]。多維傳感器使用陣列傳感器，改變了一個傳感器只對應一種分析物的模式，通過利用多維傳感器的綜合效應對每個分析物產生獨特的響應模式，從而獲得一系列目標物之間的差異，可檢測和區(qū)分多種分析物[12]。多維傳感器解決了傳統(tǒng)儀器檢測中需要大型儀器、儀器操作需專業(yè)人員、檢測成本高、檢測時間長、過程繁瑣等問題，在靈敏度、選擇性、多重檢測能力和便攜性方面具有顯著優(yōu)勢。

Cao等[13]報道了一種丹磺酰官能化熒光膜傳感器，實現了Cu2+和Hg2+的識別。Wu等[14]設計了4種具有普通聚對苯乙烯亞乙炔基（PPE）主鏈和不同離子側鏈的陰離子共軛聚電解質（CPE），通過4種PPE傳感器陣列的熒光強度響應模式，同時區(qū)分8種金屬離子。這些方法有效提高了重金屬檢測效率，但用于傳感器的材料需要通過復雜的化學合成和繁雜的處理步驟，仍存在局限性。此類具有多維信息的材料難以設計或合成，而現有的基于納米材料的傳感器大多只有一個傳感元件。由于傳感器的分辨能力嚴重依賴于傳感元件的個數，因此，這些單傳感元件的傳感器因分辨能力有限而限制了其廣泛應用[15]。開發(fā)具有不同傳感能力且易于制備的新材料是解決上述問題的關鍵。

DNA與金納米粒子（AuNPs）的組合為可擴展的多維傳感器的開發(fā)提供了解決方案。DNA易于合成，以DNA作為傳感器元件不僅可很好地解決上述傳感器材料合成困難的問題，同時，DNA堿基序列排列的多樣性也為多維傳感器識別多種分析物提供了更多的可能性[16]。AuNPs是制備多維傳感器的潛在納米材料，如將具有多維信息的DNA結合到納米材料上，就可能構建出具有無限感應元件的多維傳感器。AuNPs因具有獨特的光學性質、良好的生物兼容性和易于進行表面修飾等優(yōu)點，在生物傳感器中被廣泛應用[17]。目前，已有很多種制備AuNPs的成熟方法，如溶劑還原法、水熱法、微波合成法等，這些制備方法都比較簡單; AuNPs的物理化學性質，如等離子體共振吸收、吸收光譜、熒光猝滅效率和電導率，可通過識別元件與分析物之間的結合而改變，從而產生可被檢測的響應信號[18]。通過合理的設計，基于DNAAuNPs的多維傳感器，具有無限感測元件和出色的辨別能力。

Sun等[19]設計了一種以DNAAuNPs為傳感元件的鑒別蛋白質的雙通道（熒光、比色）三維傳感器，可區(qū)分濃度為50 nmol/L的11種蛋白質，準確度達到100%，而且可同時區(qū)分兩種具有不同濃度和物理化學性質的蛋白質和不同摩爾比的混合物。然而，此傳感器陣列需要3種FAM標記的DNA 序列作為識別元件。2017年，Wei等[20]僅用兩種無標記的ssDNA（15A和30A）作為受體陣列，依據不同的蛋白質可觸發(fā)DNA保護的AuNPs，顯示出不同的聚集行為以及各種顏色變化，開發(fā)了一種簡易的單通道二維比色傳感器，在50 nmol/L水平下，裸眼即可很好地區(qū)分12種蛋白質，相似的蛋白質混合物和未知樣品的區(qū)分精度均能達到100%。相比于Sun等[19]的研究，Wei等[20]設計的傳感器操作更便捷，識別性能更佳。在已報道的大部分文獻中，基于DNAAuNPs的多維傳感器主要應用于蛋白質的鑒別和檢測。Tan等[21]首次利用DNAAuNPs復合體系構建了一種雙通道（比色和熒光）多維傳感器，可同時檢測和鑒別9種重金屬離子，但此傳感器比較復雜，不僅需要采用3種FAM標記的DNA，同時需要熒光和比色兩種方法，檢測步驟比較繁瑣。

為了構建一種簡易的、無標記的單通道多維比色傳感器，實現多種重金屬離子的同時鑒別，本研究建立了一種無標記的重金屬離子鑒別方法。基于DNAAuNPs復合體系，在高濃度鹽的存在下，不同的金屬離子可引起不同DNA保護的AuNPs顯示出不同的聚集行為，并呈現各種顏色變化，構建了一種簡易的用于鑒別重金屬離子的比色傳感器。此比色傳感器由3個DNAAuNPs復合體系構成，分別為15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs，與11種重金屬離子產生不同的比色響應信號（吸光度變化）。以625和519 nm處的吸光度的比值K（K=A625 nm/A519? nm）量化AuNPs的聚集程度，結合主成分分析法（PCA）和線性判別分析（LDA），此傳感器可區(qū)分11種重金屬離子。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

TU1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）; PHS3C數顯酸度計（杭州奧利龍儀器有限公司）; EL204電子天平（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）; ZS90全自動電位圖像分析儀（南寧藍天科技設備）。

HAuCl4（99.9%，國藥集團試劑有限公司）; 15A、30A、45AT的DNA（HPLC純化，生工生物工程（上海）有限公司合成）。其它藥品和劑均為分析純; 實驗用為二次蒸餾水。

2.2AuNPs的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備AuNPs [20]。首先，在250 mL圓底燒瓶中加入100 mL 1 mmol/L HAuCl4溶液，加熱至沸騰，在攪拌狀態(tài)下快速加入10 mL 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，在攪拌下繼續(xù)加熱15 min，溶液逐漸變成酒紅色。冷卻至室溫，即制得檸檬酸根保護的AuNPs，于4℃保存。

2.3DNAAuNPs的制備

DNA用pH=7.4的PBS緩沖溶液配制成1 μmol/L的溶液，于95℃加熱5 min，然后逐漸冷卻至室溫。將90 μL 1 μmol/L DNA 與600 μL AuNPs溶液混合，室溫孵育12 h，得到DNAAuNPs。

2.4金屬離子的鑒別

將90 μL一定濃度的金屬離子溶液加入630 μL DNAAuNPs溶液中，在37℃下反應30 min，促進DNAAuNPs與金屬離子的結合。向上述混合物中加入180 μL 120 mmol/L NaCl溶液，檢測體系的紫外可見吸收光譜。所獲得的光譜數據用主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）方法處理。經典的PCA和LDA程序在MATLAB環(huán)境下編寫和運行，實現分類數據特征的提取。對實驗中得到的11種金屬離子的吸光度比值K及紫外可見吸收光譜進行整理，構成一定空間的矩陣。PCA和LDA這兩種模式識別方法可以此為基礎提取第一第二特征向量（及第三特征向量），對11重金屬離子進行區(qū)分鑒別。所得數據結果圖中的坐標軸即為提取的特征向量（即主成分矢量）。

3結果與討論

3.1實驗原理

基于DNAAuNPs的比色傳感器以3種無標記、非特異性的DNA序列（15A、30A、45AT）作為傳感元件，鑒別不同的重金屬離子，原理如圖1所示。檸檬酸三鈉還原法合成的AuNPs表面吸附了大量的檸檬酸根負離子，AuNPs粒子間因靜電斥力而在溶液中保持分散狀態(tài)。加入DNA后，DNA鏈上的堿基通過非共價作用吸附在AuNPs表面，DNA帶負電的磷酸鹽骨架增加了AuNPs表面的負電性，使得AuNPs在高鹽濃度下不發(fā)生團聚，對AuNPs具有保護作用。當加入金屬離子時，一方面，帶正電的金屬離子中和了堿基上磷酸基團所帶的負電荷; 另一方面，金屬離子與DNA的堿基發(fā)生相互作用，從而使DNA的保護作用被削弱，DNAAuNPs復合體系的穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，導致在高鹽濃度下AuNPs發(fā)生聚集，AuNPs溶液顏色也發(fā)生變化。不同的金屬離子與DNA的相互作用強弱不同，影響AuNPs的聚集程度及其顏色變化。合成的AuNPs在分散狀態(tài)下呈酒紅色，最大吸收波長約520 nm。當AuNPs溶液發(fā)生聚集時，隨著聚集程度增大，溶液由酒紅色變?yōu)樽仙?、藍色甚至灰色，此時溶液最大吸收波長紅移。以分別代表AuNPs分散狀態(tài)和聚集狀態(tài)時519 nm和625 nm處的吸收強度比值K（K=A625 nm/A519? nm）衡量AuNPs的聚集程度，K值越大，AuNPs的聚集程度越嚴重，以此鑒別不同的重金屬離子。

3.2AuNPs的表征

AuNPs的粒徑大小及均一性均可能影響實驗結果。合成的AuNPs的紫外可見吸收光譜如圖2A所示，特征吸收峰在519 nm處，且吸收峰尖銳，表明粒徑分布比較均勻[23]。利用全自動電位圖像分析儀對合成的AuNPs進行分析，結果如圖2B所示，AuNPs的直徑約為21 nm，粒徑較均勻。

3.3NaCl濃度的優(yōu)化

溶液的離子強度是影響AuNPs穩(wěn)定性的因素之一[24]。本傳感體系中，AuNPs聚集程度隨著NaCl的濃度增大而增大，當NaCl濃度很低時，AuNPs可長時間保持穩(wěn)定，不發(fā)生聚集。然而，如果NaCl濃度過高，DNA 保護的AuNPs也會發(fā)生明顯的聚集行為，影響傳感器對金屬離子的鑒別能力[25]。因此，選擇合適的鹽濃度尤為重要。如圖3所示，對于沒有DNA保護的AuNPs、15AAuNPs和30AAuNPs，分別以NaCl濃度變化對吸光比值K（K=A625 nm/A519 nm）作圖，由圖3可見，當加入濃度為120 mmol/L的NaCl溶液時， AuNPs和15AAuNPs之間以及AuNPs和30AAuNPs之間的K值差異達到最大值。因此，在后續(xù)實驗中選擇加入的NaCl溶液濃度均為120 mmol/L。此外，30個堿基DNA對AuNPs的保護效果優(yōu)于15個堿基DNA，推測更長序列的DNA對AuNPs保護效果更好。因此在后續(xù)實驗中還引入了45個堿基的DNA，增加了傳感器的傳感元件，檢驗其是否可更好地實現對金屬離子的鑒別。

3.4金屬離子的鑒別

3.4.1可行性實驗為了證明本比色傳感體系的可行性， 將11種常見重金屬離子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）分別加入15A DNAAuNPs和30A DNAAuNPs體系中，各金屬離子的濃度均為10 μmol/L。如圖4A所示，

不同金屬離子加入兩種不同DNA保護的AuNPs體系時，AuNPs發(fā)生聚集的程度不同，產生特定的顏色變化， 裸眼即可辨別。通過測定溶液的吸收光譜，計算每種金屬離子在兩個體系中的K值。由圖4B可見，不同重金屬離子在15AAuNPs和30AAuNPs體系中有特征的響應值K，證明此傳感器用于多種重金屬離子鑒別的可行性。

3.4.2PCA分析（1）二維比色在最佳實驗條件下，將11種濃度各為0.5 μmol/L金屬離子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）依次加入15A DNAAuNPs和30A DNAAuNPs溶液中，測定各個反應液的吸收光譜，得到22個響應信號，以K值表示，每一個樣品平行實驗次數為4次，最終獲得88個K值。

PCA是一種基于變量之間線性組合計算的建模方法，可解釋數據中的最大方差。此方法可對原始光譜變量進行轉換，得到的新變量能最大限度地表征原變量的數據結構特征，通常2個或3個主成分的累計方差足以解釋總方差，從而實現數據的降維[22]。利用PCA方法對比色傳感器獲得的88個響應K值進行判別分析，圖5為前2個主成分PCA1和PCA2組成的二維空間圖，圖5中的各個點對應為每個分析樣品的2個傳感元件（15A、30A）響應值的二維數據坐標位點。在PCA二維散點圖中，大多數樣本點集中在圖5的右側區(qū)域內，少數10個樣本點分布于圖5的左側區(qū)域，同一類樣本點分散開，不同類樣本點間相互交叉或重疊，沒有達到聚類效果。

（2）三維比色通過分析圖5數據發(fā)現，由兩個傳感元件（15A DNA和30A DNA）構成的二維傳感器對11種重金屬的鑒別能力較差，而傳感器的分辨能力與傳感元件的個數密切相關。因此，本研究增加另一條DNA鏈（45AT）作為傳感器第3個傳感元件。在最佳實驗條件下，將11種濃度為1 μmol/L的金屬離子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）分別依次加入3個體系（15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs）中反應，測量吸收光譜，產生33個響應信號，分別進行4次平行實驗，最終獲得132個響應信號和132個K值。

以每個樣品平行實驗4次測得響應值K的平均值（K0）作圖，如圖6A所示，不同的分析目標物的K值不同，即每種分析物都有對應的特征響應值。當相同濃度的同一金屬離子加入到15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs體系中，15A DNAAuNPs 體系的響應值K明顯大于其余兩個體系，30A DNAAuNPs 體系所獲得響應值略大于45AT DNAAuNPs。K值越大，表明AuNPs聚集程度越大，DNA對AuNPs的保護作用越弱。此結果也說明，DNA對AuNPs的保護作用與DNA鏈長度有關。在一定程度上，DNA鏈越長，對AuNPs的保護能力越強。其中，Zn2+在30A DNAAuNPs中的K值明顯小于在45AT DNAAuNPs中，說明45AT DNA對AuNPs的保護作用弱于30A DNA。推測原因是45AT DNA中有22個A堿基，23個T堿基，Zn2+與T堿基的相互作用強于A堿基，因此相對于30A DNA，45AT DNA對AuNPs的保護作用減弱，導致其聚集程度加大。

將比色傳感器獲得的132個響應K值數據通過PCA方法進行分析，結果如圖6B和6C所示。圖6B是前2個主成分PCA1和PCA2組成的二維空間圖，各個點對應每個分析樣品的3個傳感元件（15A、30A、45AT）響應值的二維數據坐標位點。在PCA二維散點圖中，大多數樣本點集中圖的右側區(qū)域內，少數樣本點分布于圖的左側區(qū)域，分辨能力相對于二維傳感器沒有明顯優(yōu)勢，其聚類效果依然較差。

為此增加PCA散點圖的維度，減少信號響應值在數據處理中信息缺失的可能，圖6C給出了前3個主成分PCA1、PCA2和PCA3組成的三維空間圖，圖中的各個點對應為每個分析樣品的3個傳感器（15A、30A、45AT）響應值經過處理后的三維數據坐標位點。增加一個主成分后，PCA對樣本點的聚類能力增加，同類樣本點的間距縮小，不同類的間距也隨之減小，不同類的樣本點堆積在一起，難以區(qū)分。

考慮到以K值為響應信號，無法完全反映吸收光譜圖信息，部分特征信息缺失后導致類別判別存在誤差，因此，利用K值和吸收光譜組合進行主成分分析，以3個主成分PCA1、PCA2和PCA3組成三維空間，得到的結果如圖6D所示，各點對應每個分析樣品的3個傳感元件（15A、30A、45AT DNA）的響應值（K值與吸收光譜）經過降維后的三維數據坐標位點。增加吸收光譜數據后，PCA對樣本點的聚類效果更佳，同類樣本點的間距縮小，可初步看到分類效果，但不同類樣本點依然交叉存在，未能真正實現11種重金屬鑒別區(qū)分。

綜上，在應用二維和三維通道時，金屬離子對應的響應K值不同，裸眼即可分辨出某些溶液顏色的差別，這主要是因為金屬離子和DNA之間的相互作用不同導致了AuNPs的不同狀態(tài)，進而導致吸收光譜不同，為金屬離子鑒別的提供了可能。為了更明確地展現出11種金屬離子對體系產生的各自特異性變化，分別將88個和132個數據以PCA進行處理，結果表明，即使增加一半的響應K值數據，分析鑒別的效果并沒有明顯的提升。當增加吸收光譜的數據時，吸收曲線提供了更加全面的信息，分析結果有所改善，但依然未完全區(qū)分開。因此，考慮PCA可能不適合于此類分析。

3.4.3LDA分析LDA是在輸入變量上構造線性判別函數的特征選擇方法，即尋找一種變換，使得在某種意義下類間分離性最大，類內相異性最小，是一種有監(jiān)督的維數約簡方法。LDA 充分利用了訓練樣本的類別信息，通過把原問題轉化為關于樣本集總類內散布矩陣和總類間散布矩陣的廣義特征值問題進行求解[22]。以實驗獲得的132個響應K值進行LDA分析，結果如圖7A所示，其聚類效果仍沒有改進。因此，利用實驗獲得的132個響應K值及其對應吸收光譜組合進行LDA分析，結果如圖 7B所示。由于LDA考慮到不同類間的差異，并將其擴大化，所以區(qū)分效果比主成分分析更優(yōu)，11種重金屬離子在空間區(qū)域內獲得很好的離散，同類別的樣本點幾乎重合為一個點，不同類別的樣本點之間完全

沒有重疊，容易被區(qū)分開。同時，也說明所構建的比色傳感器的對多種重金屬離子的檢測下限低于0.5 μmol/L。

4結 論

基于3條單鏈DNA對AuNPs的不同保護作用， 成功構建了一種無標記多維通道的陣列比色傳感器， 用于多種重金屬離子的鑒別。在高濃度鹽的存在下，不同的金屬離子可導致不同的DNA保護的AuNPs顯示出不同的聚集行為，并呈現各種顏色變化。優(yōu)化后的比色傳感器最佳的NaCl濃度為120 mmol/L。 以此顏色變化作為傳感器的響應信號，利用兩種方法進行鑒別。PCA對11種重金屬離子表現出有限區(qū)分能力; LDA可完全區(qū)分0.5 μmol/L的11種重金屬離子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、 Bi3+和Cr3+）。

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