主客體作用在生化分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

崔琳 趙敏惠 張春陽

摘要主客體作用是主體和客體在滿足結(jié)構(gòu)互補(bǔ)和能量匹配的條件下，通過非共價(jià)相互作用選擇性結(jié)合，形成具有特定功能的超分子的過程。生物體系中的抗原抗體、DNA蛋白質(zhì)、酶底物等生物分子之間的識(shí)別都建立在非共價(jià)作用識(shí)別的基礎(chǔ)上。主客體識(shí)別反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程動(dòng)態(tài)可逆等特點(diǎn)，不僅可有效克服共價(jià)結(jié)合的局限性，而且能在分子水平上模擬生物功能。本文綜述了主客體作用在生化分析中的應(yīng)用的最新研究進(jìn)展，并對(duì)基于主客體作用的傳感器的發(fā)展趨勢做了展望。

關(guān)鍵詞主客體作用; 生物傳感器; 超靈敏檢測; 生化分析; 評(píng)述

1引 言

主客體作用是主體和客體在滿足結(jié)構(gòu)互補(bǔ)和能量匹配等條件下，通過非共價(jià)相互作用選擇性結(jié)合形成具有某種特定功能的超分子的過程[1]。非共價(jià)相互作用包括范德華力、靜電引力、疏水作用和氫鍵等，是產(chǎn)生主客體識(shí)別作用的關(guān)鍵[2]。生物體系中抗原抗體、DNA蛋白質(zhì)、酶底物等生物分子之間的識(shí)別都建立在非共價(jià)作用的識(shí)別基礎(chǔ)上，在生物分子固定、生物傳感及生物成像等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3～5]。主客體作用在生化分析中的應(yīng)用主要是以電化學(xué)和熒光分析為手段，通過主體（如冠醚、環(huán)糊精和杯芳烴）與目標(biāo)物（客體）的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的定性與定量分析[6～10]。主客體作用具有高度選擇性與動(dòng)態(tài)可逆性等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物活性分子的快速超靈敏檢測[11～13]。近年來，研究者相繼成功構(gòu)建了多種基于主客體體系的傳感器，展現(xiàn)了廣闊應(yīng)用前景[11～15]。本文系統(tǒng)總結(jié)了主客體識(shí)別的策略以及主客體作用在蛋白質(zhì)、核酸、生物小分子、金屬離子和異構(gòu)體檢測中的應(yīng)用，并對(duì)主客體作用在生化分析中的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2主客體識(shí)別策略

基于主客體識(shí)別策略的傳感器可選擇性地與目標(biāo)物結(jié)合，受體（主體）和目標(biāo)物（客體）之間的相互作用產(chǎn)生的變化可通過傳感器轉(zhuǎn)換成可量化的信號(hào)?；谥骺腕w作用的傳感器主要包括電化學(xué)（電勢、安培和電導(dǎo)）和光學(xué)（吸光度、熒光和化學(xué)發(fā)光）傳感器[16～18]，受體包括生物活性高分子（例如酶和抗體（生物傳感器））和超分子主體（例如環(huán)糊精、冠醚和杯芳烴等（化學(xué)傳感器））[19]。

2.1基于目標(biāo)分子直接響應(yīng)的生物傳感器

主體和客體可直接通過非共價(jià)相互作用產(chǎn)生信號(hào)變化。當(dāng)主體或客體含有氧化還原活性或光活性等功能基團(tuán)時(shí)，主客體作用的發(fā)生就會(huì)改變相應(yīng)的信號(hào)（如氧化還原電位或吸收光波長），通過這些功能基團(tuán)的信號(hào)變化可準(zhǔn)確判斷是否發(fā)生了主客體作用和具體的客體分子。近年來，以冠醚為主體的熒光傳感器已相繼開發(fā)出來[15]。熒光傳感器可通過將熒光基團(tuán)結(jié)合到氮雜冠醚上而構(gòu)建，氮原子上的孤對(duì)電子易向激發(fā)態(tài)熒光活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移。在光致電子轉(zhuǎn)移過程中，當(dāng)無目標(biāo)金屬陽離子存在時(shí)，傳感器處于閉合狀態(tài)，無熒光產(chǎn)生。當(dāng)引入金屬離子后，金屬離子與冠醚形成主客體絡(luò)合物。氮雜冠醚的氮原子參與配位，孤對(duì)電子被束縛，阻礙了電子轉(zhuǎn)移，系統(tǒng)處于打開狀態(tài)，導(dǎo)致熒光恢復(fù)[20]。偶氮苯分子在有無光照的狀態(tài)下可發(fā)生順反結(jié)構(gòu)互變，對(duì)環(huán)糊精的選擇性結(jié)合具有明顯差異。

電化學(xué)傳感器通常需要電活性分子（例如亞甲基藍(lán)（MB）、二茂鐵（Fc）和硫堇（Thi）等）參與產(chǎn)生電信號(hào)[21]。主客體識(shí)別過程中，伴隨著電子從施加的電位轉(zhuǎn)移，電化學(xué)信號(hào)（例如電壓、電流和阻抗等）發(fā)生變化。線性掃描伏安法是一種常見的電化學(xué)測量方法，用于測量氧化還原電活性分子在電位變化下被氧化或還原的電流變化，其電流峰波的形狀和出峰位置可用于分析客體分子的作用機(jī)制[21]。

2.2基于競爭分子響應(yīng)的生物傳感器

由于主客體結(jié)合過程的可逆性以及不同客體分子對(duì)同一主體分子結(jié)合常數(shù)的不同，結(jié)合力強(qiáng)的客體分子可競爭結(jié)合力弱的客體分子與主體分子結(jié)合。Zhu等[22]利用羅丹明B和1氨基吡對(duì)環(huán)糊精（βCyclodextrin， βCD）的主客體作用差異檢測有機(jī)污染物1氨基吡。羅丹明B作為探針可進(jìn)入環(huán)糊精的空腔，然而具有較強(qiáng)親和力的1氨基吡可競爭羅丹明B與βCD結(jié)合，根據(jù)羅丹明B和1氨基吡的比例電化學(xué)信號(hào)變化可檢測1氨基吡。該比例電化學(xué)傳感器的靈敏度比單信號(hào)電化學(xué)傳感器高，在電活性有機(jī)污染物的檢測方面極具應(yīng)用前景。

3主客體作用在生化分析中的應(yīng)用

3.1蛋白質(zhì)的檢測

基于抗原抗體相互作用以及酶與底物相互結(jié)合的親和性，主客體作用可應(yīng)用于檢測臨床樣品中的蛋白質(zhì)，例如前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen，PSA） [23]、蛋白酶[24～30]、降鈣素原[31]，朊病毒蛋白[32]、禽白血病病毒[33]、胰島素[34]以及腫瘤標(biāo)志物（Carcinoembryonic antigen，CEA） [35，36]等。

堿基切除修復(fù)（Baseexcision repair，BER）是眾多DNA修復(fù)機(jī)制之一，其中DNA糖基化酶（如尿嘧啶DNA糖基化酶（UracilDNA glycosylase，UDG））在維持基因組完整性方面起著關(guān)鍵作用。Zhao等[24]發(fā)展了一種基于鐵嵌入的富氮碳納米管（Iron embedded nitrogenrich carbon nanotubes，F(xiàn)eCN）過氧化物模擬酶和主客體識(shí)別的電化學(xué)生物傳感器，可一步檢測尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）（圖1）。亞甲藍(lán)（MB）標(biāo)記的發(fā)夾DNA（Hairpin）連接到金納米顆粒（AuNPs）可形成MBhairpin@AuNPs探針。由于AuNPs的空間效應(yīng)和發(fā)夾DNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，MB不能進(jìn)入電極上的β環(huán)糊精（βCD）空腔。當(dāng)目標(biāo)UDG存在時(shí)，它可從發(fā)夾DNA探針莖上去除尿嘧啶，打開發(fā)卡探針。MB與βCD之間的主客體識(shí)別使MBhairpin@AuNPs探針組裝在電極表面。電解質(zhì)中L半胱氨酸（LCysteine，RSH）被氧氣氧化生成H2O2，F(xiàn)eCN模擬酶催化MB氧化，顯著增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。該傳感器可超靈敏和一步測定堿基切除修復(fù)酶（UDG）活性，檢出限為7.4×10U/mL。

[31]設(shè)計(jì)了一種基于主客體納米網(wǎng)催化擴(kuò)增檢測降鈣素原（Procalcitonin，PCT）的無酶電化學(xué)免疫傳感器。他們用聚酰胺胺型樹枝狀分子（Poly（amidoamine）dendrimer，PAMAM）包封金納米粒子作為納米載體結(jié)合環(huán)糊精βCD，得到βCD功能化的PAMAMAu（Poly（amidoamine）dendrimerencapsulated Au nanoparticles）; 同時(shí)利用二茂鐵衍生物FcFc作為橋梁結(jié)合兩個(gè)環(huán)糊精分子，進(jìn)入βCD/PAMAMAu的疏水內(nèi)腔，形成FcFc/βCD/PAMAMAu探針。二抗（Ab2）通過化學(xué)吸附作用連接到網(wǎng)狀的納米結(jié)構(gòu)上。由于抗壞血酸具有很強(qiáng)的還原性，很容易被氧化成脫氫抗壞血酸，利用FcFc和PAMAMAu協(xié)同催化抗壞血酸（Ascorbic acid，AA）氧化進(jìn)行無酶信號(hào)放大，同時(shí)利用電極上的抗體（Ab1）形成抗體抗原抗體三明治夾心結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)降鈣素原的超靈敏檢測。該傳感器具有靈敏度高和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，檢測范圍為1.80 pg/mL～500 ng/mL，檢出限為0.36 pg/mL。

Zhao等[25]將主客體識(shí)別與三重信號(hào)放大相結(jié)合，構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）生物傳感器，用于超靈敏檢測尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）（圖2）。一個(gè)雙標(biāo)記的發(fā)夾DNA探針的一端標(biāo)記Fc作為客體分子，另一端標(biāo)記FeMOF/AuNPs@luminol作為ECL標(biāo)簽。當(dāng)UDG存在時(shí)，它可從FeMOF/AuNPs@luminol修飾的發(fā)夾DNA探針的莖中去除尿嘧啶，打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并釋放魯米諾修飾的單鏈DNA（ssDNA），通過Fc和βCD之間的主客體識(shí)別進(jìn)一步將FeMOF/AuNPs@luminol修飾的ssDNAs組裝在電極表面。FeMOF中的Fe3+可與亞鐵氰化鉀反應(yīng)形成普魯士藍(lán)，催化H2O2分解，生成羥基自由基，并能進(jìn)一步與魯米諾自由基反應(yīng)產(chǎn)生放大的ECL信號(hào)。該ECL傳感器具有選擇性好和靈敏度高的特點(diǎn)，可用于篩選UDG抑制劑和細(xì)胞中UDG活性的檢測，檢出限為2.5 × 10

3.2核糖核酸檢測

核糖核酸的檢測在癌癥和病原菌檢測以及法醫(yī)學(xué)鑒定中起著重要作用。宿主客體之間相互作用依賴于非共價(jià)鍵，隨著環(huán)境條件的變化，這種非共價(jià)鍵容易被分解，而主客體作用由于非共價(jià)性質(zhì)所具有的可逆性質(zhì)可實(shí)現(xiàn)傳感器的循環(huán)利用，提高重現(xiàn)性。利用主客體作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)核糖核酸的快速超靈敏檢測[37～44]。

Zheng等[37]設(shè)計(jì)了一種利用磁性納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPs）/環(huán)糊精進(jìn)行主客體識(shí)別、分離和檢測均相溶液中乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）DNA的電化學(xué)傳感器（圖3）。他們設(shè)計(jì)了一個(gè)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針用于電化學(xué)檢測。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)通過堿基配對(duì)形成，該環(huán)中序列與靶HBV序列特異性互補(bǔ)，并在5端標(biāo)記dabcyl作為客體分子，在3端標(biāo)記金納米粒子作為電化學(xué)標(biāo)簽。在電極上修飾合成的βCD能固定磁性納米顆粒（MNPs/βCD），利用主客體識(shí)別可對(duì)DNA進(jìn)行檢測。當(dāng)無目標(biāo)DNA存在時(shí)，探針處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，客體分子不能被捕獲和檢測。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，探針展開并形成雙鏈DNA，導(dǎo)致客體分子不再與金納米粒子緊密相連，其可進(jìn)一步通過環(huán)糊精與dabcyl的主客體識(shí)別被MNPs/βCD捕獲，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。該傳感器檢出限為9.930×10

Yang等[38]采用三硫代碳酸鹽修飾柱芳烴（Trithiocarbonate modified pillar[5]arene，P5ACTA），利用柱芳烴的主客體識(shí)別和DNA雜交技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)可回收利用的電化學(xué)傳感器，用于檢測乳腺癌易感基因（Breast cancer，BRCA）。他們將BRCA靶DNA（TDNA）與亞甲基藍(lán)標(biāo)記的DNA信號(hào)探針和烷基胺修飾的捕獲DNA均質(zhì)雜交形成三明治型DNA，同時(shí)將三硫代碳酸鹽修飾柱芳烴（P5ACTA）固定在金電極上，通過P5ACTA的主客體識(shí)別捕獲三明治型DNA。移入辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase， HRP）和H2O2顯著提高了該電化學(xué)傳感器的靈敏度。該電化學(xué)傳感器線性范圍為3.3×10mol/L，檢出限為1 nmol/L。由于P5ACTA與烷基胺修飾DNA之間存在可逆的主客體作用， 該電化學(xué)傳感器可通過簡單的洗滌處理可回收利用。

Jiang等[39]將靶標(biāo)分子觸發(fā)的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)（Toeholdtriggered strand displacement reaction，TSDR）誘導(dǎo)的目標(biāo)物循壞利用和Fe3O4@SiO2@βCD的主客體作用相結(jié)合，構(gòu)建了無酶均相檢測DNA的電化學(xué)傳感器。當(dāng)無目標(biāo)DNA分子時(shí)，兩端均標(biāo)記二茂鐵（Fc）的發(fā)卡探針（Hairpin DNA，H1）莖環(huán)關(guān)閉，二茂鐵無法與磁珠上的環(huán)糊精進(jìn)行主客體識(shí)別。經(jīng)過磁分離后，上清液中含有大量Fc標(biāo)記的發(fā)卡探針H1能在電極上產(chǎn)生強(qiáng)電流信號(hào)。加入目標(biāo)DNA后，觸發(fā)輔助探針（Assistance probes，A1和A2）與H1雜交發(fā)生逐步分支遷移，產(chǎn)生更穩(wěn)定的雙鏈復(fù)合物，釋放目標(biāo)DNA，可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的循環(huán)放大?；谀繕?biāo)鏈的循環(huán)利用可連續(xù)打開大量H1探針，通過DNA和Fe3O4@SiO2@βCD之間的主客體識(shí)別，大量Fc標(biāo)記的H1探針被磁鐵吸引，上清液中殘留的探針減少，導(dǎo)致峰電流下降。該電化學(xué)傳感器的線性范圍寬（1～5000 pmol/L），檢出限為0.3 pmol/L，具有良好的選擇性。

Jiang等[40]基于氮摻雜氧化石墨烯/環(huán)糊精聚合物與Fc標(biāo)記的發(fā)卡探針的主客體識(shí)別和Mg2+輔助循環(huán)裂解反應(yīng)，構(gòu)建了可檢測目標(biāo)DNA的電化學(xué)傳感器（圖4）。他們將熱退火氧化石墨烯和三聚氰胺合成的氮摻雜氧化石墨烯（Nitrogendoped reduced graphene oxide，NRGO）分散在環(huán)糊精聚合物（βCyclodextrin polymer，βCDP）溶液中形成NRGO/βCDP納米復(fù)合材料，用于修飾玻碳電極，構(gòu)建電化學(xué)傳感器。在無目標(biāo)DNA存在時(shí)，電極上的βCDP不能識(shí)別發(fā)卡探針（H1），產(chǎn)生較小的電流信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，Subunit DNA S1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，與發(fā)卡探針 H1組裝產(chǎn)生Mg2 +依賴性DNA酶，其在Mg2+的作用下將Fc雙標(biāo)記的H1發(fā)卡探針裂解成兩個(gè)單鏈寡核苷酸，進(jìn)一步通過βCDP與Fc的主客體識(shí)別，產(chǎn)生增強(qiáng)的峰值電流。該電化學(xué)傳感器具有較高的靈敏度和選擇性，可用于DNA和miRNA檢測，線性范圍分別為0.01～1000 pmol/L和0.05～ 500 pmol/L，檢出限分別為3.2 fmol/L和18 fmol/L。

3.3生物小分子的檢測

許多生物小分子（如多巴胺（Dopamine）、腺苷、血清素和膽固醇等）在人體生命代謝活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，發(fā)展超靈敏的分析方法對(duì)這些生物小分子[45～53]進(jìn)行選擇性檢測具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前利用主客體作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)多巴胺[45，52]、氯霉素[46]、腺苷[47，53]、甾族化合物（膽固醇）[48]、烏頭堿[49]、對(duì)硝基氯苯[50]、除草劑2甲4氯（2Methyl4chlorophenoxyacetic acid，MCPA）[51]和血清素[52]等小分子的選擇性檢測。

多巴胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多巴胺缺失與帕金森疾病密切相關(guān)。Liu等[45]制備了三維氮摻雜石墨烯（3D nitrogendoped graphene，3DNG），利用環(huán)糊精的主客體作用，把3DNG作為βCD的電極基板建立一種新型的生物傳感器，應(yīng)用于多巴胺和對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen， APAP）的選擇性檢測。三維氮摻雜石墨烯的結(jié)構(gòu)類似于章魚的觸須，在它的觸角上固定環(huán)糊精分子作為吸盤去捕獲客體分子。該電化學(xué)傳感器對(duì)多巴胺和對(duì)乙酰氨基酚的檢測靈敏度分別為5468.6 μA/（mmol/L cm2） 和2419.2 μA/（mmol/L cm2）。

Wang等[46]以AuPd雙金屬納米粒子（AuPd bimetallic nanoprobe）為信號(hào)標(biāo)記，構(gòu)建了基于環(huán)糊精和金剛烷（Adamantine，ADA）主客體作用的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測氯霉素（Chloramphenicol，CAP）（圖5）。該傳感器利用AuPd納米粒子對(duì)NaBH4氧化的電催化作用產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，用于免疫分析。通過競爭免疫反應(yīng)，ADA標(biāo)記的抗體與固定在多壁碳納米管修飾的電極表面的抗原CAP特異性結(jié)合，通過環(huán)糊精和金剛烷的主客體識(shí)別，將環(huán)糊精修飾的AuPd雙金屬納米粒子固定在免疫傳感器上，導(dǎo)致AuPd納米粒子大量負(fù)載。AuPd納米粒子能高效電催化NaBH4的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，可對(duì)氯霉素進(jìn)行超靈敏檢測。該傳感器具有良好選擇性，檢測線性范圍為50 pg/mL～50 μg/mL，檢出限為4.6 pg/mL。

Yang等[47]基于三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）與羧酸二茂鐵（Ferrocenecarboxylic acid，F(xiàn)cA）和6氨基β環(huán)糊精（Per6ammoniumβcyclodextrin，pABCD）的主客體競爭反應(yīng)，利用羧酸二茂鐵（FcA）作為電化學(xué)探針選擇性檢測三磷酸腺苷。在pABCD分子中，環(huán)糊精6號(hào)位的主羥基被氨基取代，由于pABCD的空腔與腺苷堿基的主賓包合以及pABCD帶正電荷的氨基與磷酸陰離子基的相互作用，pABCD對(duì)三磷酸腺苷的結(jié)合能力較強(qiáng)。FcA作為電活性探針可包含在pABCD腔內(nèi)，產(chǎn)生較低的氧化峰電流。當(dāng)ATP加入到pABCDFcA體系中時(shí)，pABCD空腔中的羧酸二茂鐵被ATP置換，產(chǎn)生增強(qiáng)的氧化峰電流，并且氧化峰電流隨ATP的濃度呈線性變化。該傳感器選擇性好，靈敏度高，線性范圍為3.12×10

膽固醇是人體細(xì)胞和組織中的重要成分，在細(xì)胞膜的構(gòu)建中起著非常重要的作用，也是膽汁酸、維生素D和甾體激素等的生物合成前體。Yang等[48]利用環(huán)糊精/聚乙酰苯胺/石墨烯修飾電極，構(gòu)建了基于βCD與信號(hào)探針亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB）和目標(biāo)分子膽固醇的競爭性主客體識(shí)別的電化學(xué)傳感器，用于選擇性檢測膽固醇。由于主客體識(shí)別作用，MB分子可進(jìn)入βCD的疏水空腔，產(chǎn)生陽極峰電流。當(dāng)膽固醇存在時(shí)，它可與βCD發(fā)生競爭性相互作用，從而取代MB分子，導(dǎo)致氧化峰電流的降低。該傳感器檢測范圍為1～50 μmol/L，檢出限為0.5 μmol/L，可用于血清中膽固醇的檢測。

Yang等[49]設(shè)計(jì)了一種基于對(duì)磺化杯芳烴（pSulfonated calix[8]arene，SCX8）與信號(hào)探針/目標(biāo)分子之間的競爭主客體識(shí)別的雙信號(hào)電化學(xué)傳感器，應(yīng)用于烏頭堿檢測（圖6）。該傳感器分別利用亞甲基藍(lán)（MB）和烏頭堿作為探針和靶分子。由于主客體識(shí)別作用，MB分子可進(jìn)入SCX8的疏水內(nèi)腔，修飾后的SCX8/SWCNHs電極可產(chǎn)生明顯陽極峰。在烏頭堿存在時(shí)，它與SCX8發(fā)生競爭性相互作用取代MB分子，導(dǎo)致MB的氧化峰電流降低和烏頭堿的氧化峰的出現(xiàn)。該電化學(xué)傳感器對(duì)烏頭堿的線性響應(yīng)范圍為1.00～10.00 μmol/L，檢出限為0.18 μmol/L。

3.4金屬離子的檢測

金屬離子特別是重金屬離子對(duì)生物系統(tǒng)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和毒性。例如， Hg2+是一種高毒性的金屬污染物，可引發(fā)多種急慢性疾病（例如心血管疾病、腎臟損害、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)紊亂）[54]。金屬離子檢測對(duì)環(huán)境保護(hù)和疾病預(yù)防具有重要意義。基于冠醚等超分子化合物對(duì)堿金屬陽離子選擇性識(shí)別和主客體作用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子的特異性檢測[55～63]。

Hu等[55]基于宿主客體識(shí)別和THg2+T的特異性相互作用，構(gòu)建了電致發(fā)光（ECL）生物傳感器，應(yīng)用于Hg2+的檢測（圖 7）。他們將β環(huán)糊精修飾的鈀納米粒子（βCyclodextrinPd nanoparticles， βCYPdNPs）凝膠以及Ru（bpy）2+3層層組裝到玻碳電極作為傳感平臺(tái)，同時(shí)將一端帶Fc的DNA發(fā)卡探針通過βcyclodextrin（βCY）與二茂鐵的主客體識(shí)別連接到βCYPdNPs上。當(dāng)Hg2+不存在時(shí)，二茂鐵可猝滅Ru（bpy）2+3的ECL信號(hào)。當(dāng)Hg2+存在時(shí)，特異性的THg2+T相互作用使DNA發(fā)卡探針構(gòu)象發(fā)生改變，二茂鐵脫離β環(huán)糊精并且遠(yuǎn)離電極表面，導(dǎo)致ECL信號(hào)增強(qiáng)。該ECL生物傳感器的線性響應(yīng)范圍為0.003～600 ng/mL，檢出限為0.0015 ng/mL。

基于冠醚等大分子修飾的不對(duì)稱納米孔的電化學(xué)傳感器可用于堿金屬離子的檢測[56～62]。PérezMitta等[59]利用冠醚對(duì)單個(gè)錐形納米孔進(jìn)行修飾，構(gòu)建了可檢測跨膜離子電流的納米器件。納米孔壁上發(fā)生的主客體離子識(shí)別過程可改變納米孔的靜電特性和整流特性。他們利用主客體化學(xué)，結(jié)合納米流體元素，模擬特定生物通道的離子傳輸特性和門控功能。冠醚功能化納米孔可特異性地與鉀離子和鈉離子結(jié)合，導(dǎo)致孔外電子讀數(shù)發(fā)生顯著變化[60]。Ali等[61，62]將納米流體裝置和杯冠醚功能化納米孔相結(jié)合，用于檢測銫離子和鋰離子。

Yao等[63]構(gòu)建了基于水溶性柱狀芳烴（Watersoluble pillar[5]arene，WP5）和水溶性季銨鹽二亞胺衍生物（Watersoluble quaternized perylene diimide derivative，G）超分子主客體體系（WP5G）的電化學(xué)傳感器，可選擇性檢測Fe3+。G在水溶液中可形成具有強(qiáng)熒光的不規(guī)則團(tuán)聚體。當(dāng)加入WP5時(shí)，WP5（供體）和G（受體）發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron transfer，PET）反應(yīng)，導(dǎo)致G熒光猝滅。當(dāng)Fe3+存在時(shí)，F(xiàn)e3+與柱芳烴的主客體識(shí)別可阻斷超分子PET反應(yīng)，導(dǎo)致G熒光恢復(fù)。該傳感器可特異性檢測Fe3+，檢出限為2.13 ×10

3.5異構(gòu)體的檢測

大多數(shù)活性物質(zhì)都具有手性，手性對(duì)映體的性能對(duì)生物活性、毒性、轉(zhuǎn)運(yùn)過程和代謝途徑等方面的影響存在較大差異。通常情況下，只有一種異構(gòu)體表現(xiàn)出完美的活性，而另一種可能無活性甚至?xí)饑?yán)重的副作用[64～66]。手性識(shí)別一直是化學(xué)和生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大多數(shù)主體分子對(duì)不同的異構(gòu)體具有不同的結(jié)合力，因而可利用主客體作用對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行選擇性檢測[67～71]。

Yi等[67]利用還原石墨烯包裹的碳納米管（Carbon nanotubes wrapped with reduced graphene，CNTs@rGO）的協(xié)同作用和βCD與不同的目標(biāo)物結(jié)合親和力的不同，構(gòu)建了雙信號(hào)電化學(xué)傳感器，可用于手性識(shí)別苯丙氨酸對(duì)映體（圖8）。該傳感器利用羅丹明B（RhB）和苯丙氨酸對(duì)映體（D苯丙氨酸和L苯丙氨酸）作為電化學(xué)指示劑。由于主客體識(shí)別作用，RhB可進(jìn)入βCD的空腔，產(chǎn)生氧化峰電流。由于L苯丙氨酸（LPhenylalanine）和βCD之間具有較強(qiáng)的親和力，L苯丙氨酸（LPhenylalanine）可與βCD空腔內(nèi)的RhB發(fā)生競爭反應(yīng)，導(dǎo)致RhB峰電流減少和L苯丙氨酸峰值電流的出現(xiàn)。這兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)的變化與L苯丙氨酸的濃度呈線性關(guān)系。但是，D苯丙氨酸和βCD之間的親和力較弱，D苯丙氨酸不能取代RhB，因而不會(huì)發(fā)生RhB峰值電流變化。該雙信號(hào)電化學(xué)傳感器在0.05～22.0 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)外消旋混合物中L苯丙氨酸對(duì)映體有較好的線性響應(yīng)，檢出限為0.013 μmol/L，同時(shí)比單信號(hào)傳感器具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。

Liang等[68]基于三維石墨烯與羥丙基β環(huán)糊精（Hydroxypropylβcyclodextrin，HPβCD）的耦合，利用HPβCD作為超分子手性識(shí)別元件以及三維石墨烯（3DG）作為電化學(xué)指示劑，構(gòu)建了基于差分脈沖伏安法（DPV）的電化學(xué)傳感器，用于識(shí)別色氨酸對(duì)映體。HPβCD對(duì)D色氨酸（DTrp）和L色氨酸（LTrp）具有不同主客體識(shí)別作用，其對(duì)靶L色氨酸結(jié)合親和力較高，可用于色氨酸異構(gòu)體檢測。該傳感器對(duì)這兩種對(duì)映體的線性響應(yīng)范圍均為0.5～175 μmol/L，對(duì)LTrp和DTrp的檢出限分別為9.6 nmol/L和38 nmol/L。

Yang等[69]集成主客體識(shí)別作用和內(nèi)部濾波效應(yīng)，構(gòu)建了基于熒光金納米團(tuán)簇的傳感器陣列（Gold nanoclusters，AuNCs），可用于識(shí)別硝基苯酚異構(gòu)體。該傳感器陣列裝配3個(gè)不同的配體和βCD， 以及3個(gè)不同熒光發(fā)射的金納米團(tuán)簇，通過對(duì)3種硝基苯酚同分異構(gòu)體熒光猝滅模式的線性判別分析，可對(duì)3種硝基苯酚同分異構(gòu)體進(jìn)行快速鑒別。該傳感器陣列對(duì)于對(duì)硝基苯酚的線性檢測范圍為1～50 μmol/L， 檢出限為0.21 μmol/L。另外，該傳感器陣列不僅具有單一異構(gòu)體識(shí)別能力，而且可區(qū)分鄰硝基苯酚和對(duì)硝基苯酚兩種異構(gòu)體。

4總結(jié)與展望

綜上所述，基于主客體作用的生物傳感器可利用冠醚、環(huán)糊精和杯芳烴等主體分子對(duì)蛋白質(zhì)[2336]、核糖核酸 [37～44]、生物小分子[45～53]、金屬離子[55～63]和異構(gòu)體[67～71]進(jìn)行選擇性檢測，展示了廣闊應(yīng)用前景，但仍有許多問題有待解決。尤其是，基于主客體作用的傳感器在生物分子的識(shí)別應(yīng)用中多為單點(diǎn)識(shí)別。后續(xù)研究應(yīng)側(cè)重以下幾個(gè)方面： （1）結(jié)合生物活性分子的特性構(gòu)造相應(yīng)的主體化合物，實(shí)現(xiàn)傳感器固定化、器件化和傳感器的重復(fù)利用，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)分析檢測過程的簡便化與綠色化; （2）通過修飾功能性官能團(tuán)或利用主體間協(xié)同作用構(gòu)建混合主體，為客體提供更多識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多重識(shí)別; （3）由超分子主體化合物設(shè)計(jì)合成生物模擬化合物（如蛋白質(zhì)模擬化合物），這些化合物具有類似于抗原或酶的基質(zhì)選擇性識(shí)別機(jī)制，不僅穩(wěn)定，而且價(jià)格低，可進(jìn)一步用于研究其與核酸和蛋白質(zhì)的相互作用，有望促進(jìn)生物體內(nèi)生理過程的研究。未來對(duì)分子識(shí)別的研究應(yīng)向更高效和更廣泛應(yīng)用的方向發(fā)展。

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