γ-氨基丁酸的研究與應(yīng)用進(jìn)展

(濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布在動植物、微生物中[1]，由于物種不同，因此其所發(fā)揮的作用也不同。在哺乳動物體內(nèi)，GABA是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]，不僅參與多種代謝活動，還具有治療癲癇[3]、預(yù)防肥胖、鎮(zhèn)定安神[4]、健肝[5]、利腎[6-7]、促進(jìn)乙醇代謝[8]、增強(qiáng)腦活力[9]、調(diào)節(jié)激素代謝[10]、降血壓[11]等功效。GABA在植物中的主要作用是抵抗環(huán)境脅迫[12-13]，在微生物中的主要作用則是提高微生物的耐酸能力[14]及孢子的萌發(fā)效率[15]。本文中主要從GABA的產(chǎn)生途徑、谷氨酸脫羧酶(GAD)的分子結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)、GABA的生產(chǎn)技術(shù)等幾方面進(jìn)行綜述，以期能為其生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和完善提供參考。

1 GABA的產(chǎn)生途徑

在生物體內(nèi)，GABA產(chǎn)生途徑有2種，分別是GABA支路和多胺降解途徑[16]。其中GABA支路廣泛存在于動、植物及微生物中，是生物體中產(chǎn)生GABA的主要途徑。該支路是三羧酸循環(huán)的一條支路，三羧酸循環(huán)中的α-酮戊二酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨產(chǎn)生L-谷氨酸(L-Glu)，L-Glu在GAD的作用下脫羧生成GABA，在發(fā)揮生物學(xué)功能之后，可以通過GABA轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨，進(jìn)而氧化為琥珀酸，再進(jìn)入三羧酸循環(huán)(見圖1)。然而，當(dāng)植物組織受到逆境環(huán)境刺激時，GABA支路產(chǎn)生的GABA不足，多胺降解途徑作為GABA生產(chǎn)的輔助途徑在植物體中出現(xiàn)。該途徑是植物細(xì)胞內(nèi)的腐胺、多胺在二胺氧化酶或多胺氧化酶的作用下經(jīng)脫氨、脫氫生成GABA(見圖2)[16-17]。

圖1 γ-氨基丁酸支路

圖2 多胺降解途徑

GABA支路作為生物體中產(chǎn)生GABA的主要途徑，GAD在該支路中是產(chǎn)生GABA的關(guān)鍵限速酶，因此在提升GABA產(chǎn)量中起到了關(guān)鍵作用。

2 谷氨酸脫羧酶

GAD是一種磷酸吡哆醛(PLP)類酶[18]，是催化L-Glu脫羧生成GABA唯一的關(guān)鍵限速酶[19]，對L-Glu具有高度專一性[20]，對溫度敏感[21]，在pH大于6.0或小于2.0時[22]都會失活。

2.1 谷氨酸脫羧酶的分子結(jié)構(gòu)

2.1.1 酶蛋白

生物體中的GAD為胞內(nèi)酶，一般由多個相同的亞基組成，不同物種GAD的亞基數(shù)量不同。研究表明，GAD是一種由酸脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的胞內(nèi)酶，大腸桿菌(Escherichiacoli)的GAD為六聚體[23]，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、紅曲霉(Monascuspurpureus)的GAD均為二聚體[24-26]，屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的GAD為單體[27]，它們亞基的結(jié)構(gòu)基本相同，但是亞基的氨基酸組成會因物種不同而有差異[28]。GAD單個亞基里含有1個分子的PLP輔酶[29]，此外，該亞基的多肽鏈大約有480個氨基酸殘基[15]，由N-端結(jié)構(gòu)域、PLP結(jié)合區(qū)域以及C-端結(jié)構(gòu)域3個部分組成(見圖3)，PLP結(jié)合區(qū)域存在一個可移動的催化環(huán)(圖3中用虛線標(biāo)出)，當(dāng)PLP與催化環(huán)的氨基酸殘基結(jié)合時，催化環(huán)發(fā)生位移將PLP拉入PLP結(jié)合區(qū)域使GAD具有催化活性[30]。生物體可以通過PLP和催化環(huán)的解離與結(jié)合來調(diào)節(jié)GAD的活性[31]。

圖3 谷氨酸脫羧酶單個亞基結(jié)構(gòu)

齊育平等[32]以其實驗室篩選出的短乳桿菌Lb-2菌株的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)為模板克隆了GAD基因。他們利用LaserGene序列工具軟件、NCBI blast、ExPASy數(shù)據(jù)庫及GOR Ⅰ軟件對Lb-2菌株的GAD基因進(jìn)行了分析預(yù)測，并利用LaserGene中的ORF Finder及相應(yīng)軟件分析預(yù)測了GAD基因的氨基酸組成及序列(見表1、圖4)，利用GOR I預(yù)測了GAD單個亞基的二級結(jié)構(gòu)(見圖5)。結(jié)果顯示，該亞基共有468個氨基酸殘基，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)卷曲分別占總數(shù)的51.71%、8.12%、31.20%、8.97%；利用SWISS-MOD-EL軟件預(yù)測了短乳桿菌Lb-2中GAD單個亞基的三級結(jié)構(gòu)模型(見圖6)。

2.1.2 活性中心

GAD活性中心包括PLP、GAD多肽鏈PLP結(jié)合區(qū)域的第276、464位的賴氨酸殘基(Lys276、Lys464)，第163位的谷氨酰胺殘基(Gln163)，第243位的天冬氨酸殘基(Asp243)，第245位的丙氨酸殘基(Ala245)，第275、465位的組氨酸殘基(His275、His465)，第463位的苯丙氨酸殘基(Phe463)。PLP與Lys276通過共價鍵結(jié)合(見圖7)，形成一種棒狀結(jié)構(gòu)，PLP再以分子間氫鍵與活性中心其他氨基酸殘基結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支撐見圖8[33]。

表1 短乳桿菌Lb-2中谷氨酸脫羧酶的氨基酸組成

圖4 短乳桿菌Lb-2中谷氨酸脫羧酶基因及氨基酸序列

圖5 GOR I預(yù)測的短乳桿菌Lb-2的谷氨酸脫羧酶二級結(jié)構(gòu)圖譜

圖6 短乳桿菌Lb-2的谷氨酸脫羧酶三級結(jié)構(gòu)模型

當(dāng)L-Glu或其鹽進(jìn)入GAD的活性中心時，PLP與Lys276結(jié)合的共價鍵斷裂，L-Glu分別以共價鍵與PLP、Lys276結(jié)合，進(jìn)行α-脫羧反應(yīng)。PLP-Lys276棒狀結(jié)構(gòu)對pH敏感，光譜學(xué)性質(zhì)差異很大，會影響L-Glu在活性中心的結(jié)合，從而影響GAD的活性。相比之下，Thr466與活性中心的PLP結(jié)合，則會“鎖住”活性中心，阻止L-Glu及其鹽進(jìn)入活性中心，從而降低GAD的活性[34]。

Asp—天冬氨酸殘基；Lys—賴氨酸殘莖；His—組氨酸殘基。圖7 磷酸吡哆醛、谷氨酸與谷氨酸脫羧酶活性位點中賴氨酸殘基的結(jié)合方式

His275、His465—第275、465位組氨酸殘基；Lys276、Lys464—第276、464位賴氨酸殘基；Phe463—第463位的苯丙氨酸殘基;Gln163—第163位的谷氨酰胺殘基;Asp243—第243位的天冬氨酸殘基;Ala245—第245位的丙氨酸殘基。圖8 磷酸吡哆醛與相鄰氨基酸殘基之間的分子內(nèi)相互作用

2.2 酶促反應(yīng)

GAD的輔酶是PLP[35]，α-脫羧反應(yīng)的最適宜pH為4.0～5.0[36]，最適宜反應(yīng)溫度為40～50 ℃[37]。GAD可以催化進(jìn)入其活性中心的L-Glu或其鹽發(fā)生不可逆的α-脫羧反應(yīng)[38]。L-Glu進(jìn)入菌體內(nèi)，與GAD活性中心的PLP結(jié)合形成醌類結(jié)構(gòu)，在pH為3.5～6.0時，在轉(zhuǎn)醛亞胺的作用下形成Schiff堿，之后L-Glu羧基上的1個電子進(jìn)入吡啶環(huán)，Schiff堿發(fā)生質(zhì)子化，L-Glu脫去1個分子的CO2得到H+，α-脫羧反應(yīng)完成，L-Glu脫羧成為GABA。

GAD在微生物不同的生長周期中表達(dá)量差異很大，穩(wěn)定生長期表達(dá)量最多，而指數(shù)生長期幾乎不表達(dá)[39]。激活GAD的方式很多，驟冷、驟熱、組織損傷、低氧、缺水、高滲透壓等逆境協(xié)迫和添加激活劑都可以使GAD活性增大[40],GAD的激活劑有很多[41]，以Ca2+為代表的金屬離子激活劑最為常見[42]，同時Cu2+、Ag+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Li+、Ba2+等金屬離子也可以使GAD活性增強(qiáng)[43-45]。

3 GABA生產(chǎn)及應(yīng)用

GABA生產(chǎn)方法主要有3種，分別是化學(xué)合成法、植物富集法、微生物發(fā)酵法，它們在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用各不相同。本文中將對各種生產(chǎn)方法進(jìn)行詳細(xì)論述。

3.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法生產(chǎn)制備GABA的工藝有很多，主要可以分為以下3種：其一，堿性條件下，2-吡咯烷酮(C4H7NO)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，再經(jīng)過脫色、重結(jié)晶、提純得到GABA[46]；其二，高溫下，鄰苯二甲酞亞氨鉀(C8H4KNO2)和γ-氯丁氰(C4H6ClN)反應(yīng)，之后經(jīng)過回流、結(jié)晶、提純得到GABA[47]；其三，γ-丁內(nèi)酯(C4H6O2)和氯化亞砜(SOCl2)反應(yīng)，經(jīng)過氯化、?；苯?、皂化合成GABA[48]。以上工藝生產(chǎn)的GABA純度高；但生產(chǎn)過程能耗高，對溫度要求嚴(yán)格，污染環(huán)境，安全性差，成本高，不符合綠色生產(chǎn)的理念，因此這些生產(chǎn)工藝不被業(yè)內(nèi)所推崇。

3.2 植物富集法

植物富集法是通過植物組織的應(yīng)激代謝來富集GABA[49-50]。通常植物體內(nèi)富集的GABA含量較低，分離提純很難。例如經(jīng)過富集處理的GABA茶中GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅有0.401%[51]，發(fā)芽的糙米中GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅有0.042%[52]，因此植物富集法不適用于大規(guī)模生產(chǎn)GABA，只適用于GABA富集產(chǎn)品的開發(fā)，例如米類、豆類、麥類等糧食及其他經(jīng)濟(jì)作物在經(jīng)過富集后，可以直接加工成食品、功能性飲料以及牲畜的飼料[53-55]等。該生產(chǎn)方法只需分離純化GABA，就可以滿足當(dāng)今消費(fèi)者的需求，也是糧食深加工的一個潛在領(lǐng)域[56]。

3.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用微生物體內(nèi)的GAD將L-Glu或其鹽脫羧轉(zhuǎn)化成GABA[57]。該方法具有專一性高、設(shè)備簡單、環(huán)保、成本低、生產(chǎn)菌種多樣且易獲得等優(yōu)點，適用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[58]。常見的能夠產(chǎn)生GABA的菌種如表2所示，大腸桿菌發(fā)酵液中的GABA質(zhì)量濃度最高達(dá)到了297 g/L，乳酸菌發(fā)酵液中GABA質(zhì)量濃度達(dá)到了76.36 g/L，而釀酒酵母、紅曲霉、屎腸球菌GABA的產(chǎn)量很低，所以目前常用的GABA生產(chǎn)菌種是大腸桿菌和乳酸菌。衛(wèi)生部公布的食品新資源目錄中，生產(chǎn)GABA的菌種是乳酸菌，因此大腸桿菌僅能作為飼料級GABA的生產(chǎn)菌種。

表2 能夠生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌種及其產(chǎn)量

畢金麗等[59]分別對大腸桿菌BL21、DH5a的GAD基因進(jìn)行了定點突變，構(gòu)建了突變型轉(zhuǎn)基因工程菌。在突變型與野生型大腸桿菌具有相同酶活力的前提下，突變型GAD具有更廣泛的pH(3.4～6.2)適應(yīng)能力，這樣的突變型GAD將更加符合工業(yè)生產(chǎn)的需要，可以有效減緩GABA發(fā)酵液對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕，在飼料添加劑等行業(yè)生產(chǎn)實踐意義重大。李超等[60]發(fā)現(xiàn)在持續(xù)高溫的夏天，在肉雞的每千克日糧中如果加入50 mg的GABA，可以調(diào)節(jié)肉雞的內(nèi)分泌機(jī)制[61]，增強(qiáng)免疫力，降低肉雞的直腸溫度，減緩肉雞的熱應(yīng)激反應(yīng)，從而提高肉雞的存活率和雞肉品質(zhì)。陳強(qiáng)等[62]發(fā)現(xiàn)如果在母豬的每千克飼料中添加60 mg GABA，經(jīng)對比分析，添加GABA組比未添加GABA組母豬的泌乳量增加了32.85%，仔豬成活率增加了23.35%，而GABA對母豬整個的生殖周期無顯著影響，這也為GABA飼料的進(jìn)一步應(yīng)用提供了參考。

乳酸菌作為最常用的菌種，長期用于乳制品、泡菜等食品行業(yè)[63-64]，被歸類為“一般公認(rèn)安全菌種” (GRAS級)，是理想的GAD基因和細(xì)胞工廠來源[65-66]。汪祥燕等[67]利用紙層析法在泡菜中篩選出一株短乳桿菌Y-3，該菌種發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度達(dá)到了12 g/L。黃俊[25]利用短乳桿菌hjxj-08119進(jìn)行了小試生產(chǎn)，經(jīng)4次補(bǔ)料，發(fā)酵72 h后，發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度達(dá)到了76.36 g/L。

以上這些研究都表明，與其他2種方法相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA更具有開發(fā)前景，也更值得深入研究。

4 結(jié)論

GABA分布廣泛，功效眾多，GABA支路是其產(chǎn)生的主要途徑。GABA支路中生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵限速酶是GAD，該酶是由一個或多個相同的亞基組成，每個亞基的結(jié)構(gòu)以及活性中心都基本相同。GAD可以通過激活劑以及逆境刺激激活使GABA的產(chǎn)生量增加。GABA的生產(chǎn)方法主要有3種，化學(xué)合成法生產(chǎn)GABA安全性差、成本高，植物富集法生產(chǎn)的GABA產(chǎn)量低、分離提純困難，而通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的GABA不僅產(chǎn)量高，而且安全性好，應(yīng)用前景廣闊，因此，研究開發(fā)GAD活力更高、生長周期更短、GABA產(chǎn)量更高的安全菌種以及更加簡便的GABA分離提取設(shè)備，是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)GABA的研究熱點，具有重要的應(yīng)用價值。