樺木酸對(duì)T-2毒素致小鼠腸道氧化損傷的保護(hù)作用

黃城龍，朱利娟，易想煉，黃 琳，歐朝萍，馬玉容，鄔 靜,2,3，李榮芳,2,3,*，易金娥,2,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，目前已確認(rèn)的約有300多種霉菌代謝產(chǎn)物僅對(duì)人和動(dòng)物有毒[1]。據(jù)估計(jì)，全球約25%的農(nóng)產(chǎn)品在一定程度上受到霉菌毒素的污染[2]，而單端孢霉烯族毒素是農(nóng)業(yè)上對(duì)全球健康構(gòu)成潛在危害的最重要的真菌毒素之一[1]。早在1973年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織就將單端孢霉烯族毒素列為最危險(xiǎn)的天然存在的食品污染毒物之一。單端孢霉烯族真菌毒素從結(jié)構(gòu)上可分為A、B、C、D 4 種類(lèi)型[3]，B類(lèi)最常見(jiàn)，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通常稱為大環(huán)單族毒素。而A類(lèi)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，為非大環(huán)類(lèi)，通常由鐮孢菌產(chǎn)生。在動(dòng)物體內(nèi)，A類(lèi)單端孢霉烯族真菌毒素的毒性為B類(lèi)的10～100 倍，而T-2毒素屬于A類(lèi)單端孢霉烯族，是此類(lèi)毒素中急性毒性最強(qiáng)的毒素[4]。T-2毒素廣泛分布在小麥、大麥、燕麥、玉米、谷物以及動(dòng)物飼料中，其性質(zhì)穩(wěn)定，難以清除，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等都有較強(qiáng)的損害作用[5-6]。研究報(bào)道，T-2毒素能夠降低腸上皮細(xì)胞的存活率[7]，從而損害腸道屏障，造成動(dòng)物和人類(lèi)的腸道疾病[8]。近年來(lái)大量研究表明，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激是T-2毒素毒性作用發(fā)揮的基本機(jī)制之一[9]。據(jù)報(bào)道，4.8 mg/kg mbT-2毒素能誘導(dǎo)蝦明顯的氧化損傷[10]，4 mg/kg mbT-2毒素能廣泛引起大鼠肝臟、脾臟、胸腺和胃組織氧化損傷[11]。

氧化損傷與許多人類(lèi)疾病密切相關(guān)。事實(shí)上，許多疾病的病理基礎(chǔ)都是氧化損傷[12]。在所有完全分化的器官中，由于腸細(xì)胞更新頻繁，不斷暴露于外源性物質(zhì)中，腸組織比其他器官更容易受到氧化損傷[13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，各種腸道疾病，甚至它們的致病因素，都與氧化損傷有關(guān)。因此，尋找一種天然有效的抗氧化劑，對(duì)于維護(hù)腸道健康和預(yù)防疾病的發(fā)生具有重要意義。

樺木酸（betulinic acid，BA）是一種來(lái)源于羽扇豆的三萜化合物，廣泛存在于食品、水果、蔬菜和植物中。BA是一種具有多種生物學(xué)活性的天然活性物質(zhì)，如抗氧化應(yīng)激、抗炎、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗瘧疾以及抗艾滋病毒等。本課題組對(duì)BA的免疫調(diào)控和抗氧化作用開(kāi)展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)BA能夠緩解酒精性肝損傷[3]，調(diào)控地塞米松誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡[14]，減輕環(huán)磷酰胺造成的腸道氧化損傷[15]，這些保護(hù)作用都與BA的抗氧化能力有關(guān)。那么，對(duì)于霉菌毒素造成的腸道氧化損傷，BA是否同樣具有預(yù)防性保護(hù)作用？對(duì)此目前鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給小鼠進(jìn)行T-2毒素攻毒建立腸道氧化損傷模型，研究BA對(duì)機(jī)體的體液免疫、腸道黏膜屏障功能以及抗氧化能力的影響，為BA的抗氧化作用以及功能性食品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性KM小鼠60 只，體質(zhì)量（20±2）g，4～5 周，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司（生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0004），使用M02小鼠普通飼料飼喂。

T-2毒素 新加坡Pribolab公司；BA 美國(guó)Sigma公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色液 武漢谷歌生物科技有限公司；免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒武漢華美生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-24全自動(dòng)樣品快速研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司；AFX1-0501-P超純水儀 臺(tái)灣艾科浦公司；5404EQ220531高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；超薄切片機(jī) 德國(guó)Leica公司；U410-86 超低溫冰箱 英國(guó)New Brunswick Scientific公司；AY220電子天平 日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組與給藥

BA和T-2毒素的劑量根據(jù)前期研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定[3,14]，VE作為陽(yáng)性對(duì)照組[16]。將健康雄性KM小鼠置于室溫（22～25 ℃）、相對(duì)濕度為50%～70%的動(dòng)物飼養(yǎng)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為6 組（n＝10），分別為對(duì)照組，T-2毒素組，BA低、中、高劑量組（0.25、0.5、1 mg/kg mbBA+T-2毒素），VE組（100 mg/kg mbVE+T-2毒素）。將BA與VE混懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉中進(jìn)行灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃14 d，對(duì)照組和T-2毒素組灌服可溶性淀粉。最后一次灌胃10 h后，除空白對(duì)照組注射等量乙醇＋磷酸鹽緩沖液混合液外，其余各組將T-2毒素溶于磷酸鹽緩沖液與乙醇溶液，腹腔注射4 mg/kg mbT-2毒素，建立腸道氧化損傷模型。

1.3.2 樣本采集與相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

小鼠自由飲水，禁食15 h后，眼球采血，3 000 r/min離心15 min，收集血清，用ELISA法檢測(cè)IgG、IgM、DAO水平；取小腸組織（十二指腸、空腸和回腸）于生理鹽水中輕輕晃動(dòng)除凈腸道內(nèi)容物，其中將一部分空腸固定于福爾馬林中，用于H & E染色觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，剩余十二指腸、空腸和回腸部分制成10%組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)CAT、GSH-Px、MDA、GSH等氧化指標(biāo)水平和各組織蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差法，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA對(duì)T-2毒素致小鼠血清IgG和IgM水平的影響

機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)維持機(jī)體的健康至關(guān)重要。IgG是機(jī)體體液免疫的重要指標(biāo)，具有抗菌和中和病毒的作用。在原發(fā)性免疫應(yīng)答中，大多數(shù)Ig屬于IgM類(lèi)，在宿主對(duì)抗病原體的前線防御中起著至關(guān)重要的作用[17]。它們能引起可溶性抗原的沉積，從而提高免疫系統(tǒng)通過(guò)吞噬作用消除抗原的能力，保護(hù)機(jī)體免受感染和損傷。

圖1 BA對(duì)T-2毒素致小鼠血清IgG（A）和IgM（B）水平的影響Fig. 1 Effect of BA on IgG (A) and IgM (B) levels in serum of mice treated with T-2 toxin

如圖1所示，與對(duì)照組相比，T-2毒素降低了小鼠血清中IgM質(zhì)量濃度（P＞0.05）；與T-2毒素組相比，中、高劑量的BA預(yù)處理顯著升高了血清中IgG和IgM質(zhì)量濃度（P＜0.01，P＜0.05）；同樣VE預(yù)處理顯著升高血清中IgG和IgM質(zhì)量濃度（P＜0.05）。說(shuō)明BA和VE都能夠提高小鼠的機(jī)體免疫力。

2.2 BA對(duì)T-2毒素致小鼠血清DAO活力的影響

圖2 BA對(duì)T-2毒素致小鼠血清DAO活力的影響Fig. 2 Effect of BA on DAO activity in serum of mice treated with T-2 toxin

DAO是由小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種胞內(nèi)酶，血清DAO的水平與腸屏障損傷和修復(fù)密切相關(guān)[18-20]。如圖2所示，與對(duì)照組相比，T-2毒素升高了血清中DAO活力（P＞0.05）。與T-2毒素組相比，各劑量組BA均降低了血清DAO的活力，其中高劑量組差異極顯著（P＜0.01）；VE組預(yù)處理后極顯著降低了血清中DAO的活力（P＜0.01）。這說(shuō)明了BA和VE都能夠改善小鼠腸道的屏障功能。

2.3 BA對(duì)T-2毒素致小腸CAT活力的影響

CAT是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的第一道防線，能夠催化無(wú)機(jī)過(guò)氧化物H2O2發(fā)生水解，從而保護(hù)機(jī)體不被自由基侵害。由圖3可知，與對(duì)照組相比，T-2毒素組顯著或極顯著降低十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.01，P＜0.05）；與T-2毒素組相比，BA各劑量組均顯著或極顯著增強(qiáng)十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.01，P＜0.05），VE組能顯著增強(qiáng)十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.05）。

圖3 BA對(duì)T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）CAT活力的影響Fig. 3 Effect of BA on CAT activity in duodenum (A), jejunum (B) and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

2.4 BA對(duì)T-2毒素致小鼠小腸GSH-Px活力的影響

圖4 BA對(duì)T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）GSH-Px活力的影響Fig. 4 Effect of BA on GSH-Px activity in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶，能夠保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化。由圖4可知，與對(duì)照組相比，T-2毒素組顯著降低十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.05）；BA預(yù)處理后，極顯著增強(qiáng)十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.01），中劑量的BA極顯著增強(qiáng)回腸GSH-Px活性（P＜0.01），VE極顯著升高十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.01）。

2.5 BA對(duì)T-2毒素致小鼠小腸MDA含量的影響

圖5 BA對(duì)T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）MDA含量的影響Fig. 5 Effect of BA on MDA contents in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物，被認(rèn)為是氧化損傷的生物標(biāo)志物。由圖5可知，T-2毒素顯著或極顯著升高了十二指腸、空腸和回腸MDA含量（P＜0.01，P＜0.05）；與T-2毒素組相比，BA各劑量組極顯著降低十二指腸和空腸MDA含量（P＜0.01），低和中劑量的BA極顯著降低回腸MDA含量（P＜0.01），同樣，VE顯著或極顯著降低各腸段MDA含量（P＜0.01，P＜0.05）。

2.6 BA對(duì)T-2毒素致小腸GSH含量的影響

GSH作為GSH-Px的輔助因子，在機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中同樣發(fā)揮著重要作用。由圖6可知，與對(duì)照組相比，T-2毒素組極顯著降低了空腸GSH含量（P＜0.01）；與T-2毒素組相比，BA各組能提高各腸段GSH水平，以空腸差異極顯著（P＜0.01），VE也能極顯著提高空腸GSH含量（P＜0.01）。

圖6 BA對(duì)T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）GSH含量的影響Fig. 6 Effect of BA on GSH contents in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

2.7 BA對(duì)T-2毒素致小鼠空腸形態(tài)的影響

圖7 H & E染色觀察BA對(duì)T-2毒素致小鼠空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（100×）Fig. 7 Effect of BA on intestinal morphological structure in mice treated with T-2 toxin evaluated by H & E staining (100 ×)

如圖7所示，對(duì)照組小鼠腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)正常（圖7A）；T-2毒素引起腸絨毛排列不整齊，腸絨毛變短，不同程度斷裂或溶解，腸絨毛間松散，隱窩加深等現(xiàn)象（圖7B）；BA預(yù)處理后，能改善腸絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)，腸絨毛相對(duì)較長(zhǎng)，排列較規(guī)則，絨毛間隙相對(duì)較緊湊（圖7C～E），VE預(yù)處理同樣改善腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖7F）。

3 討 論

腸道的健康對(duì)于機(jī)體的健康至關(guān)重要，食物的攝取和消化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收都要通過(guò)腸道組織，又因?yàn)槟c道使機(jī)體與外界直接相接觸，極其容易受到微生物的侵染，所以腸道也是機(jī)體最易發(fā)生氧化損傷的場(chǎng)所之一。血清免疫球蛋白能通過(guò)與抗原結(jié)合達(dá)到清除病原體、中和毒素和增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性而發(fā)揮抗衰老作用，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其含量一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[21]。血清中IgA、IgG和IgM是免疫反應(yīng)中常見(jiàn)的免疫球蛋白，是機(jī)體體液免疫的分子基礎(chǔ)，發(fā)揮著特異性免疫作用，起著免疫防護(hù)作用。IgG是人體內(nèi)含量最多的免疫球蛋白，是免疫的主力軍，IgM不能通過(guò)血管壁，多存在于血液中，是初次免疫應(yīng)答反應(yīng)中出現(xiàn)最早的抗體，被稱為免疫反應(yīng)的先頭部隊(duì)[22]。當(dāng)機(jī)體受到外界抗原物質(zhì)刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA等，迅速招募具有吞噬功能的先天性免疫細(xì)胞（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞），激活炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受損傷[23-24]。大量研究證明，T-2毒素廣泛分布于自然界中，與人類(lèi)日常生活密切相關(guān)，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康有很大潛在危害性，特別是在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)方面危害性極大[25]。在本研究中，T-2毒素處理后，小鼠血清中IgM水平下降；而B(niǎo)A預(yù)處理后，中、高劑量組均顯著提高了血清IgG、IgM水平，這表明BA可能通過(guò)提高機(jī)體體液免疫能力來(lái)保護(hù)腸道的健康。DAO是一種細(xì)胞內(nèi)酶，在小腸絨毛頂端的腸細(xì)胞中尤為豐富，故其在小腸中活性最高。而在正常機(jī)體血清中其活性都很低，當(dāng)腸黏膜細(xì)胞壞死或腸黏膜屏障功能衰竭時(shí)，會(huì)造成腸絨毛損傷脫落，從而進(jìn)入血液中，使其在血液中的活性升高。因此，血液中DAO的活性變化能夠很好地反映腸道黏膜的損傷程度[26]。本實(shí)驗(yàn)中，T-2毒素組血清中DAO活性的變化差異不顯著，但表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。結(jié)合腸道組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在T-2造模組引起腸絨毛排列不整齊，腸絨毛變短，不同程度斷裂或溶解，腸絨毛間松散，隱窩加深等現(xiàn)象，這也進(jìn)一步驗(yàn)證T-2毒素在一定程度上破壞了腸黏膜的完整性，造成腸道黏膜損傷，腸絨毛斷裂，進(jìn)而誘發(fā)腸道黏膜屏障功能障礙。而B(niǎo)A預(yù)處理后能改善腸絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)，緩解腸絨毛縮短，使其恢復(fù)規(guī)則的排列，同時(shí)BA還能提高T-2誘導(dǎo)小鼠血清中DAO的活性，其中BA高劑量組差異極顯著。這說(shuō)明BA可緩解T-2誘導(dǎo)腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞，有效地降低腸黏膜的通透性，具有預(yù)防性保護(hù)腸道黏膜損傷，增強(qiáng)腸道屏障功能的作用。

在正常的生理狀態(tài)下，動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化防御和促氧化作用處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。如果失衡會(huì)導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自由基含量的升高，引起氧化應(yīng)激[27-28]。當(dāng)體內(nèi)ROS和自由基的產(chǎn)生超過(guò)了腸道組織的抗氧化防御系統(tǒng)的能力就會(huì)造成腸道組織氧化損傷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾和脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而引起腸道組織功能障礙和疾病的產(chǎn)生[29]。因此，機(jī)體只有通過(guò)加強(qiáng)合成抗氧化酶和修復(fù)生理系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激。正常腸黏膜具有高效的抗氧化防御系統(tǒng)，包括SOD、CAT和GSH-Px等酶，以及GSH和金屬硫蛋白等非酶類(lèi)小分子[30]。SOD通過(guò)催化超氧陰離子生成過(guò)氧化氫（H2O2）；CAT和GSH-Px具有及時(shí)消除歧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基，分解其他過(guò)氧化物的作用，能夠?qū)2O2轉(zhuǎn)化成水。GSH為衡量氧化應(yīng)激標(biāo)志性指標(biāo)，對(duì)機(jī)體抗氧化能力同樣發(fā)揮著重要作用[31]。當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境毒素的侵害，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，CAT和GSH-Px的酶活性會(huì)降低，GSH含量會(huì)減少，MDA含量會(huì)升高[32-34]。Chaudhari等[10]報(bào)道T-2毒素可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果與其一致，在T-2毒素作用下，小鼠小腸各腸段（十二指腸、空腸和回腸）的CAT、GSH-Px活性均下降，GSH含量均減少，MDA含量均升高，這說(shuō)明T-2毒素誘發(fā)小鼠腸道發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，腸道氧化損傷模型構(gòu)建成功。本實(shí)驗(yàn)用BA進(jìn)行預(yù)處理，能夠緩解T-2毒素引起的腸道CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性的下降，提高腸道GSH水平，降低MDA含量，這說(shuō)明BA通過(guò)提高腸道抗氧化能力對(duì)腸道氧化損傷起到預(yù)防性保護(hù)作用。這與前期研究結(jié)果一致，BA通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力減緩地塞米松或環(huán)磷酰胺致淋巴細(xì)胞氧化損傷[14-15,32-33]。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，BA對(duì)十二指腸、空腸和回腸3個(gè)腸段的氧化損傷具有保護(hù)作用，其中BA預(yù)處理恢復(fù)空腸抗氧化防御和促氧化作用系統(tǒng)的平衡較為明顯，這可能與空腸的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，空腸是小腸中最長(zhǎng)的一段，空腸各種消化酶活性均較高，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的主要部位，而影響消化酶活性的物質(zhì)也影響抗氧化指標(biāo)[35-36]，所以BA可能有選擇性地提高空腸抗氧化酶的活性，降低MDA的含量。具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

BA可以通過(guò)提高小鼠血清IgG、IgM水平，提高機(jī)體體液免疫功能，通過(guò)減少血清DAO活性，緩解腸道結(jié)構(gòu)的破壞，從而增強(qiáng)腸黏膜屏障功能，同時(shí)通過(guò)提高小腸各腸段的CAT、GSH-Px、GSH水平、降低MDA含量來(lái)提高腸道抗氧化能力，對(duì)T-2毒素引起的小鼠腸黏膜氧化損傷起到預(yù)防性的保護(hù)作用。