超聲處理對紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

杜 琛，尹歡歡，趙城彬*，許秀穎，曹 勇，吳玉柱，張 浩，劉景圣*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118）

葉黃素是一種具有抗氧化作用的天然類胡蘿卜素，廣泛存在于綠色植物中，在玉米、萬壽菊中含量豐富。有越來越多的證據(jù)表明葉黃素可以改善人體健康，延緩老化，并且能夠抑制白內(nèi)障和黃斑變性這兩種常見眼病的發(fā)生[1]。紅豆（Phaseolus angularis）又名赤豆，是一種高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)豐富的食品。Meng等[2]對紅豆中的蛋白質(zhì)做了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)紅豆中約50%的蛋白質(zhì)為球蛋白，其中7S球蛋白為主要的組成成分，11S球蛋白次之；紅豆球蛋白的氨基酸組成優(yōu)于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)，通過圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)，紅豆蛋白富含α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角。

近年來，蛋白質(zhì)與具有抗氧化作用的小分子如茶多酚、花青素、姜黃素、槲皮素等物質(zhì)結(jié)合后發(fā)生物理化學(xué)性質(zhì)的變化以及發(fā)生變化后的蛋白質(zhì)對于健康的影響已經(jīng)成為研究的一大熱點(diǎn)。Chen Gang等[3]發(fā)現(xiàn)添加0.08%的茶多酚能夠使大豆蛋白溶解度增加至0.50 g/mL，乳化活性提高約3 倍，達(dá)43.5%。Sui Xiaonan等[4]指出花青素的加入改變了大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加。Chen Feiping等[5]報道了超聲處理下大豆分離蛋白與姜黃素絡(luò)合顯著增加了蛋白質(zhì)的粒徑和ζ-電位，但導(dǎo)致表面疏水性的降低。Wang Yufang等[6]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素與大豆蛋白結(jié)合后，其2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)自由基清除能力優(yōu)于游離槲皮素。目前，蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合的研究多集中于動物蛋白，如乳蛋白、魚類蛋白、牛血清白蛋白等，植物蛋白主要是大豆蛋白，而與紅豆蛋白結(jié)合的研究相對較少。

超聲波處理技術(shù)引起了食品工業(yè)的日益關(guān)注。超聲波在食品中可用于輔助提取、滅菌、乳化、結(jié)晶、干燥等，主要是利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)等。Hu Hao等[7]報道大豆蛋白的游離巰基含量、表面疏水性和溶解度經(jīng)超聲波處理后均增加，而這些性質(zhì)的改變可能有利于蛋白質(zhì)與葉黃素的結(jié)合。為研究超聲處理能否促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合，從而提高葉黃素對紅豆蛋白的修飾和功能改善作用，本實(shí)驗(yàn)采用超聲處理制備紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物，采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀分析其熱特性和二級結(jié)構(gòu)，并研究其表面疏水性、巰基含量、溶解度、起泡和乳化特性，試圖探究結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)改善之間的構(gòu)效關(guān)系，從而為研發(fā)功能性紅豆蛋白及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料所用紅豆為‘白紅11號’（蛋白質(zhì)21.59%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、淀粉56.82%、脂肪0.74%、纖維7.98%、水分8.12%、灰分3.43%），購自吉林省白城市，將紅豆中不完整的、有蟲眼的顆粒及雜質(zhì)除去，挑選顆粒光滑飽滿、大小均勻的籽粒作為實(shí)驗(yàn)材料。玉米葉黃素為小麥和玉米深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室自制。

8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS） 上海源葉生物科技有限公司；溴化鉀、5,5’-二巰基-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Genview公司；乙酸乙酯（純度99.5%）、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ST300 pH計奧豪斯儀器（常州）有限公司；PC-620D磁力攪拌器美國Corning公司；723PC可見分光光度計 上海歐茂儀器有限公司；JY98-IIIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；K1100全自動凱氏定氮儀濟(jì)南海能儀器股份有限公司；FLUO star Omega多功能酶標(biāo)儀 德國BMG LRBTECH公司；Alpha1-4LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Q2000 DSC 美國TA公司；VERTEX 70 FTIR儀 德國Bruker公司；FA28間歇式高剪切機(jī) 德國Fluko公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆蛋白提取

根據(jù)徐向東[8]的方法，并稍作修改。稱取豆粒，按1∶5（m/V）的比例加入蒸餾水在室溫下浸泡24 h。將浸泡過的豆瓣去除種皮和胚芽，并沖洗干凈。分批按質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水后利用打漿機(jī)將其充分打磨成漿，將豆渣和豆?jié){的混合物過100 目篩，此步驟重復(fù)3～4 次，棄去篩上物。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8～9，室溫下攪拌4 h，使蛋白質(zhì)充分溶解，用離心機(jī)4 000 r/min離心15 min。分離上清液，將沉淀重復(fù)以上步驟，合并上清液。將所得溶液用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，室溫下攪拌30 min，4 000 r/min離心15 min，將沉淀復(fù)溶后用HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為7，然后冷凍干燥即得到紅豆蛋白。采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》）測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到紅豆蛋白中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.87%。

1.3.2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物制備

將紅豆蛋白溶解于pH 7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，用磁力攪拌器攪拌4 h形成1 g/100 mL的蛋白溶液，保存在4 ℃下。將葉黃素分散在乙醇中使其濃度為2 mmol/L，貯存在4 ℃下備用。在磁力攪拌下將葉黃素溶液逐漸滴加到紅豆蛋白溶液中，使葉黃素濃度為60 μmol/L，而蛋白質(zhì)量濃度保持不變，在室溫下繼續(xù)攪拌1 h，得到紅豆蛋白-葉黃素混合液。將混合液置于冰浴中，使其溫度低于2 ℃，然后將超聲探頭插入液面以下，距離溶液底部1 cm處，在20 kHz的頻率下按表1進(jìn)行超聲處理，超聲處理采用間歇式，即每次超聲4 s，間隔2 s。對超聲處理后的溶液一部分進(jìn)行結(jié)合率的測定，另一部分溶液冷凍干燥，貯存在室溫下的密封袋中備用。對照組為未經(jīng)過超聲處理的紅豆蛋白-葉黃素混合液，其他操作與超聲處理的樣品相同。

表1 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物制備的超聲處理條件Table 1 Ultrasonic treatment conditions for preparation of red bean protein-lutein complexes

1.3.3 結(jié)合率的測定

將超聲處理后的溶液在5 000 r/min下離心20 min，取上清液進(jìn)行萃取。在攪拌條件下，按體積比為1∶3的比例加入乙酸乙酯萃取溶液30 s，然后靜置30 min，使其完全分離成乙酸乙酯和水層，測定上清液在500 nm波長處的吸光度。將2 mmol/L的葉黃素醇溶液加入到一定體積的乙酸乙酯中，使乙酸乙酯中葉黃素濃度分別為25、50、75、100、200 μmol/L，然后測定溶液在500 nm波長處的吸光度，得到以葉黃素濃度為x、吸光度為y的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.009 2x+0.012 8（R2＝0.999 2）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到上清液的葉黃素濃度，再通過公式（1）計算葉黃素的結(jié)合率。

1.3.4 熱特性的測定

樣品的熱特性通過DSC測定，參考趙城彬等[9]的方法。稱取2 mg樣品粉末于鋁盤中，密封壓片后，放入DSC中準(zhǔn)備測定，以空鋁盤為對照，測定條件為掃描速率10 ℃/min，掃描范圍25～200 ℃。

1.3.5 FTIR光譜的測定

根據(jù)Zhao Chengbin等[10]的方法，使用FTIR儀分析樣品蛋白的二級結(jié)構(gòu)。將樣品與KBr以1∶100（m/m）混合均勻，并進(jìn)行壓片。光譜記錄在600～4 000 cm-1的范圍內(nèi)，并且以4 cm-1的分辨率進(jìn)行11 次掃描。通過Peakfit 4.12軟件擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的特征峰。

1.3.6 表面疏水性的測定

按照Zhao Chengbin等[11]的方法并進(jìn)行了一些修改，使用熒光探針ANS測定樣品的表面疏水性。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋樣品得到0.01、0.02、0.05、1.00 mg/mL溶液，取8 mmol/L的ANS溶液20 μL與蛋白質(zhì)溶液2 mL混合，并在25 ℃下靜置3 min。將試樣（200 μL）置于96 孔酶標(biāo)板中用于熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）的測定。建立以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、FI值為縱坐標(biāo)的曲線，并將這些曲線的初始斜率作為表面疏水性。

1.3.7 巰基含量的測定

用Ellman試劑法[12]測定巰基含量。總巰基含量測定：用Tris-Gly緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.04 mol/L EDTA，pH 8）配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的DTNB溶液，即Ellman試劑。測定時，將15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly緩沖液，加入50 μL Ellman試劑，在25 ℃條件下保溫反應(yīng)1 h，5 000×g離心10 min，取上清液在412 nm波長處測定吸光度，以等量蒸餾水替代樣品作為空白對照。游離巰基含量測定：除Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、0.04 mol/L EDTA、8 mol/L尿素，pH 8）與總巰基含量測定時不同，其余步驟均相同。

1.3.8 溶解度的測定

將樣品溶液（5 mg/mL）以10 000×g離心20 min，收集上清液，通過凱氏定氮法測定氮含量/（g/g），蛋白質(zhì)溶解度通過公式（2）計算。

1.3.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

取10 mL 0.1 g/100 mL待測樣品溶液（樣品溶于pH 7的磷酸鹽緩沖液中），加入大豆油3 mL，在室溫下用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌1 min，迅速從底部取樣，用0.1 g/100 mL的十二烷基硫酸鈉溶液將其稀釋100 倍，然后在500 nm波長處測定其吸光度（A0），以A0表征乳化性；在25 ℃下放置30 min后，再測500 nm波長處的吸光度（A30）。乳化穩(wěn)定性通過公式（3）計算。

1.3.10 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

取20 mL 1 g/100 mL的樣品溶液使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min攪打2 min產(chǎn)生泡沫。記錄剛形成泡沫的樣品溶液的體積（V0/mL）；靜置30 min后，記錄體積（V30/mL）。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別通過公式（4）、（5）計算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有測定至少設(shè)3 個平行，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲處理下復(fù)合體系中紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合率

圖1 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的結(jié)合率Fig. 1 Binding rate of red bean protein-lutein complexes

如圖1所示，與未進(jìn)行超聲處理的對照組相比，在不同超聲處理條件下，紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合率得到不同程度的提高，由65.18%（對照組）提高到71.70%～91.82%，在240 W超聲處理10 min（處理5）時結(jié)合率達(dá)到最大，表明超聲處理可以促進(jìn)葉黃素與紅豆蛋白的結(jié)合。無論超聲功率的強(qiáng)弱，隨著超聲時間的延長，結(jié)合率先升高后下降；而超聲時間較短（5 min）時，結(jié)合率隨超聲功率升高而升高，超聲10 min時，呈先增加后減少的趨勢，超聲時間達(dá)20 min時，超聲功率越大其結(jié)合率反而越小。原因可能是適度的超聲處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開，使疏水基團(tuán)更多地暴露，從而導(dǎo)致超聲促進(jìn)了葉黃素與蛋白質(zhì)的結(jié)合；而過度超聲處理嚴(yán)重破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新聚集[13]，阻礙了其與葉黃素的結(jié)合。

2.2 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱特性分析結(jié)果

圖2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的DSC圖Fig. 2 Differential scanning calorimetric thermograms of red bean protein-lutein complexes

峰值溫度（Tp）反映蛋白質(zhì)的變性溫度，熱焓變（ΔH）表示誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性所需的熱量，而蛋白質(zhì)有序構(gòu)象的情況可以通過ΔH反映[14]。由圖2可知，所有紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物與紅豆蛋白都是在100 ℃附近出現(xiàn)一個吸收峰，經(jīng)過超聲處理的復(fù)合物比對照組的圖譜稍向左偏移。葉黃素晶體在157 ℃出現(xiàn)熔融峰，而復(fù)合物在此溫度未見熔融峰，說明葉黃素以無定形形式存在于粉末顆粒中，表明紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的形成。

表2為紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)。與紅豆蛋白相比，對照組的Tp由108.34 ℃下降至101.10 ℃，ΔH從283.90 J/g減少至270.90 J/g，說明紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的變性溫度降低，在變性時所需的熱量減少。超聲處理后復(fù)合物的Tp和ΔH進(jìn)一步降低，但是Tp下降得并不顯著（P＞0.05），而ΔH顯著下降（P＜0.05），且在240 W超聲處理10 min（處理5）時Tp和ΔH達(dá)到最低，這可能與此超聲條件下較高的結(jié)合率有關(guān)。此外，Nazari等[15]對超聲處理谷子蛋白的功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超聲作用也能夠促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散和無序化，這有可能利于蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改善。然而，高功率長時間的超聲處理（360 W、20 min）又會使ΔH有所上升，這可能是蛋白質(zhì)分子重新聚集導(dǎo)致的[16]。

表2 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of red bean protein-lutein complexes

2.3 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的FTIR分析結(jié)果

由圖3可知，紅豆蛋白的FTIR光譜與紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物不同，主要是在3 100～3 600 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，復(fù)合物形成了較寬的強(qiáng)吸收峰，表明這些官能團(tuán)參與了與葉黃素的結(jié)合，形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-葉黃素復(fù)合物，這一結(jié)果與Xiang Huan等[17]對大豆蛋白-姜黃素復(fù)合物的研究結(jié)果類似。葉黃素的加入引起了紅豆蛋白的酰胺II帶從1 572 cm-1移至1 541 cm-1處，說明葉黃素引起了紅豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。Shen Fei等[18]研究卵清蛋白和茶多酚的相互作用發(fā)現(xiàn)，在pH 7.5的條件下加入茶多酚后卵清蛋白的酰胺I、II帶發(fā)生藍(lán)移。常用酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）和酰胺II帶（1 600～1 500 cm-1）的紅外吸收光譜研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，酰胺I帶的特征振動取決于C＝O與N—H之間的氫鍵性質(zhì)，酰胺II帶主要是由C—N伸縮振動和N—H彎曲振動產(chǎn)生的[19]。與紅豆蛋白相比，無論是否經(jīng)過超聲處理，紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的酰胺I帶和酰胺II帶的紅外吸收強(qiáng)度都出現(xiàn)增加，這表明葉黃素分子中的氧原子、羥基與蛋白分子中C＝O、C—N基團(tuán)可能通過疏水作用力等結(jié)合[20]，說明葉黃素使紅豆蛋白二級結(jié)構(gòu)有一定程度的改變。

圖3 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的FTIR光譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of red bean protein-lutein complexes

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定量關(guān)系與其酰胺I帶的光譜吸收密切相關(guān)，通過Peakfit 4.12軟件擬合得到紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果見表3。對照組與紅豆蛋白相比，α-螺旋相對含量降低4.78%，β-折疊相對含量降低7.02%，無規(guī)卷曲相對含量增加17.93%，β-轉(zhuǎn)角相對含量沒有顯著變化（P＞0.05），這說明紅豆蛋白與葉黃素結(jié)合后，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變得無序，花青素與大豆分離蛋白的相互作用也是類似結(jié)果[4]。不同超聲處理條件對紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)具有不同影響。在低功率和短時間（處理1）的超聲處理下，與對照組相比，復(fù)合物的α-螺旋相對含量減少，無規(guī)卷曲相對含量增加，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量均沒有顯著變化（P＞0.05），這說明低功率和短時間的超聲處理能夠使復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲，這種轉(zhuǎn)變在240 W超聲處理10 min（處理5）時效果最明顯。α-螺旋是通過肽鏈的內(nèi)部氫鍵穩(wěn)定，而β-折疊通過肽鍵之間的氫鍵而穩(wěn)定，由于超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，氫鍵被削弱，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得無序和靈活[21]，這也可能是超聲能夠促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素結(jié)合的原因，進(jìn)而利于蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的發(fā)揮[22]。然而，隨著超聲處理的不斷進(jìn)行，在高功率和長時間的超聲處理下，復(fù)合物的α-螺旋和β-折疊相對含量降低，β-轉(zhuǎn)角相對含量開始增加，而無規(guī)卷曲相對含量變化不顯著（P＞0.05），這說明高功率和長時間的超聲處理可能不利于α-螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而是轉(zhuǎn)變成另一種有序的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。然而，Hu Hao等[7]在對大豆分離蛋白進(jìn)行超聲波處理時發(fā)現(xiàn)，高功率（400 W和600 W）、長時間（30 min）超聲處理可以增加α-螺旋相對含量，減少β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果矛盾，這可能是超聲條件、溶劑環(huán)境、蛋白質(zhì)類型等不同導(dǎo)致的。

表3 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents of red bean protein-lutein complexes

2.4 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的表面疏水性

圖4 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of red bean protein-lutein complexes

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征與極性水環(huán)境接觸的蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)數(shù)目的指標(biāo)，并且與其乳化性質(zhì)密切相關(guān)。由圖4可知，葉黃素與紅豆蛋白的結(jié)合使蛋白質(zhì)表面疏水性顯著下降（P＜0.05），這可能是由于葉黃素與蛋白質(zhì)通過疏水鍵結(jié)合，這一現(xiàn)象與對姜黃素-大豆分離蛋白復(fù)合物的研究結(jié)果[5]一致。經(jīng)超聲處理后的復(fù)合物表面疏水性顯著升高（P＜0.05），且高于紅豆蛋白，這表明超聲處理對紅豆蛋白表面疏水性的增加作用大于葉黃素對表面疏水性的降低作用。對β-伴大豆球蛋白[23]和黑豆蛋白[24]進(jìn)行超聲處理時，也觀察到類似現(xiàn)象。隨著超聲功率增加和超聲時間的延長，表面疏水性呈先升高后降低的趨勢，在240 W超聲處理10 min（處理5）時，復(fù)合物的表面疏水性達(dá)到最大。這表明適當(dāng)?shù)某曁幚碚T導(dǎo)蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定程度的解折疊，從而導(dǎo)致最初在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和區(qū)域暴露于極性環(huán)境的數(shù)量增加；當(dāng)超聲處理過度時，蛋白顆粒之間通過靜電等非共價作用發(fā)生聚集，導(dǎo)致部分疏水基團(tuán)又被重新包埋。

2.5 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的巰基含量

圖5 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的巰基含量Fig. 5 Sulfhydryl contents of red bean protein-lutein complexes

含有巰基的功能蛋白主要是通過巰基與二硫鍵的相互轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)其功能的。游離巰基對于維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)有重要作用，可參與次級鍵的形成，其含量能夠反映蛋白質(zhì)的變性程度，但是極容易被氧化成二硫鍵。由圖5可知，葉黃素的結(jié)合使紅豆蛋白游離巰基含量顯著下降（P＜0.05），這可能是由于蛋白質(zhì)與葉黃素中羥基基團(tuán)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致巰基含量的下降，Sui Xiaonan等[4]在花青素-大豆蛋白復(fù)合物的研究中也觀察到類似的現(xiàn)象。超聲處理可使紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的游離巰基含量顯著升高（P＜0.05），這可能是由于超聲處理改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，破壞了蛋白質(zhì)分子之間的一些二硫鍵，形成新的游離巰基[25]。與未經(jīng)超聲處理的復(fù)合物相比，在較短超聲時間（5 min）處理時，復(fù)合物的游離巰基含量增加，且隨超聲功率增加而增加，但低于紅豆蛋白的游離巰基含量。當(dāng)超聲條件達(dá)到240 W處理10 min（處理5）以后，復(fù)合物的游離巰基含量高于紅豆蛋白，這表明適當(dāng)?shù)某曁幚砟軌蛴行б种迫~黃素對紅豆蛋白游離巰基的降低作用，甚至改善其游離巰基的暴露。然而，在較高超聲功率（360 W）和較長超聲時間（20 min）處理時，復(fù)合物的游離巰基含量相較于處理5、6、7、8組而言又有一定程度的降低，這可能是長時間高功率的處理使游離出來的巰基被氧化導(dǎo)致的[26]。對于總巰基含量，經(jīng)不同超聲處理后，其變化并沒有明顯的趨勢，這一現(xiàn)象與Jambrak等[27]的研究結(jié)果一致。

2.6 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的溶解度

蛋白質(zhì)與水之間的作用力主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵（偶極-偶極相互作用或氫鍵），或氨基酸的側(cè)鏈（解離的、極性甚至非極性基團(tuán)）同水分子之間發(fā)生了相互作用，蛋白質(zhì)變性的程度也可以通過蛋白質(zhì)溶解度評價。由圖6可知，與葉黃素的結(jié)合能夠顯著提高紅豆蛋白的溶解度（P＜0.05），其原因可能歸結(jié)于葉黃素與蛋白質(zhì)之間的非共價作用使蛋白的表面疏水性下降（圖4）。與對照組相比，所有經(jīng)超聲處理的紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的溶解度均顯著增加（P＜0.05）。從整體上看，隨著超聲時間延長及超聲功率的增加，紅豆蛋白的溶解度呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)超聲條件為240 W處理20 min（處理5）時，復(fù)合物的溶解度達(dá)到最大值（71.48%），這可能與復(fù)合物具有較高的結(jié)合率有關(guān)。這意味著適當(dāng)?shù)某曁幚砜蛇M(jìn)一步提高蛋白質(zhì)-葉黃素復(fù)合物的溶解度。一方面，超聲的空化作用能夠破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子展開，分子體積減小，與水的相互接觸面積增大，從而導(dǎo)致溶解度的增加[7]；另一方面，超聲處理使蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)與水的相互作用，因此復(fù)合物的溶解度有所提高。然而，過度超聲處理會使將蛋白質(zhì)分子聚集在一起的一些物理作用力遭到高強(qiáng)度超聲的破壞，釋放出不溶性蛋白質(zhì)聚集體，導(dǎo)致溶解度降低[28]。

2.7 不同超聲處理下紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性

圖7 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性及乳化穩(wěn)定性Fig. 7 Emulsifying capacity and emulsion stability of red bean protein-lutein complexes

由圖7可知，與未處理的紅豆蛋白相比，紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性均有所增加，但是變化不顯著（P＞0.05）。蛋白質(zhì)乳化作用與其溶解度和表面疏水性均有關(guān)，雖然與葉黃素的結(jié)合使紅豆蛋白的溶解度增加，但會降低其表面疏水性，這可能是導(dǎo)致其乳化性沒有顯著變化的原因。與對照組相比，超聲處理會顯著提高復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性（P＜0.05）。隨著超聲功率的增加和超聲時間的延長，乳化性先增加后減小。在較低功率（120 W）或較短時間（5 min）的超聲處理下，復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性隨超聲處理時間延長或超聲功率增加呈增加趨勢；而在高功率（360 W）和長時間（20 min）的超聲處理下，復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性與360 W、10 min和240 W、20 min處理組相比出現(xiàn)了顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)超聲條件為240 W處理10 min（處理5）時，乳化性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大，這與此超聲條件下復(fù)合物具有最高的溶解度和表面疏水性有關(guān)。適當(dāng)?shù)某暪β剩?40 W）和處理時間（10 min）能夠使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分散，蛋白質(zhì)發(fā)生適度變性，有效暴露出疏水基團(tuán)，同時增強(qiáng)其溶解度，促進(jìn)了蛋白質(zhì)與葉黃素的相互作用，從而使乳化性和乳化穩(wěn)定性提高[29]。此外，此超聲條件下復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加松散、熱穩(wěn)定性更低，二級結(jié)構(gòu)更加無序和靈活，這也可能是導(dǎo)致乳化作用增強(qiáng)的原因。然而，高功率（360 W）和長時間（20 min）的超聲處理會使蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，產(chǎn)生較多的不溶性蛋白[30]。同時，過度超聲處理使復(fù)合物中蛋白質(zhì)分子重新聚集，使其結(jié)構(gòu)更加緊密和有序，導(dǎo)致其乳化作用降低，與DSC和FTIR分析結(jié)果符合。研究證明不同超聲處理對大豆蛋白在油-水界面的結(jié)構(gòu)重排分散產(chǎn)生不同的影響，從而表現(xiàn)出不同的乳化性和乳化穩(wěn)定性[27]。

2.8 起泡性及泡沫穩(wěn)定性分析

圖8 紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig. 8 Foaming capacity and foam stability of red bean protein-lutein complexes

由圖8可知，與未處理的紅豆蛋白相比，與葉黃素的結(jié)合不會使蛋白質(zhì)的起泡性發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。然而，超聲處理可以顯著提高紅豆蛋白-葉黃素復(fù)合物的起泡性。隨超聲時間延長或超聲功率增加，在較低功率（120 W）或較短時間（5 min）的超聲處理下復(fù)合物的起泡性呈增加趨勢；而在較長時間（20 min）時，復(fù)合物的起泡性又顯著降低（P＜0.05），同時在功率240W、10 min處理下起泡性最大，這說明適當(dāng)?shù)某曁幚砟軌蛴行Ц纳茝?fù)合物的起泡性。這可能是由于超聲作用使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，在提高表面疏水性的同時降低了氣-水界面的表面張力[31]。畢爽等[32]研究指出蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理解聚成小分子亞基，增加了氣-水界面的蛋白分子數(shù)目，導(dǎo)致起泡能力提高。而高功率和長時間的超聲作用使復(fù)合物中蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致其起泡性的降低。此外，復(fù)合物起泡性的變化也可能與超聲作用引起其結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，這在本實(shí)驗(yàn)熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)的分析中可以得到證明。紅豆蛋白與葉黃素形成復(fù)合物后泡沫穩(wěn)定性沒有顯著變化（P＞0.05），且超聲處理也不會明顯改善復(fù)合物的泡沫穩(wěn)定性，這與大豆蛋白[13]和蛋清蛋白[25]經(jīng)超聲處理的研究結(jié)果一致。然而，Tan等[33]指出隨著超聲功率增加和超聲時間的延長，乳清蛋白泡沫穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生這種差異的原因可能與蛋白質(zhì)種類和濃度、分子結(jié)構(gòu)、親水/疏水能力以及超聲處理條件等因素有關(guān)。

3 結(jié) 論

超聲處理能夠促進(jìn)紅豆蛋白與葉黃素的結(jié)合，在240 W超聲處理10 min時，結(jié)合率達(dá)到最大（91.82%）。熱特性分析表明紅豆蛋白與葉黃素形成了復(fù)合物，復(fù)合物的形成使峰值溫度（Tp）和熱焓值（ΔH）降低，超聲處理會使復(fù)合物的Tp和ΔH進(jìn)一步下降，結(jié)構(gòu)變得松散。適當(dāng)?shù)某曁幚頃箯?fù)合物二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，無序化增加導(dǎo)致表面疏水性和游離巰基含量升高。功能性質(zhì)分析表明與葉黃素的結(jié)合增加了紅豆蛋白的溶解度，而復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性以及起泡性和泡沫穩(wěn)定性沒有顯著改變。超聲處理進(jìn)一步改善了復(fù)合物的功能性質(zhì)，在240 W超聲處理10 min時，復(fù)合物的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性達(dá)到最大。然而超聲處理并未對復(fù)合物的泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響。這些功能性質(zhì)的改善可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的松散和無序化程度增加有關(guān)。