紫果西番蓮果皮花色苷鑒定及其生物活性

何 丹，孔鈺婷，宋洪波,2,*，安風平，黃 群,2

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學 福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

西番蓮（Passiflora edulis）原產(chǎn)于南美洲，在許多熱帶和亞熱帶國家均有種植，是最受歡迎的濃郁芳香水果之一，近年來在我國廣西、廣東、江西及福建等省已規(guī)模種植。西番蓮具有豐富的營養(yǎng)成分及促健康作用[1]，目前其加工以果汁和濃縮果汁為主[2]，果皮（占果實質(zhì)量的50%～55%）通常被廢棄。研究報道，紫果西番蓮果皮中含有豐富的果膠、膳食纖維、黃酮類化合物及花色苷，其花色苷含量比藍莓、桑葚和葡萄等水果高[3-5]。花色苷是天然色素的主要成分之一，可賦予水果、蔬菜和花卉等植物藍色、紅色和紫色[6]。研究表明，花色苷能夠改善胰島素抵抗和保護β細胞[7]，作用機制主要與其抗氧化活性有關，也可能與對酶的抑制作用或其他途徑存在關聯(lián)[8]；此外，花色苷還能夠抑制和減少促炎細胞因子的分泌，使其具有一定的抗炎[9]和抗糖尿病活性[10]。本研究旨在明確紫果西番蓮果皮中花色苷的組成，評估其中花色苷的體外抗氧化活性及其對2型糖尿病相關酶活力的抑制作用，通過模擬胃腸道消化對其生物利用度進行初步研究，以期為紫果西番蓮果皮中花色苷的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紫香1號’紫果西番蓮購于福建省龍巖市漳平市拱橋鎮(zhèn)。

無水乙醇、鹽酸、氯化鉀和無水乙酸鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G） 法國Extrasynthese公司；D101型大孔吸附樹脂 艾美科健（中國）生物醫(yī)藥有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、胃蛋白酶（30 000 U/mg）、膽汁鹽、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenylα-D-glucopyranoside，PNPG）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 上海源葉生物有限公司；2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS） 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16型臺式高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀、6520型高效液相色譜-四極桿飛行時間-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight-tandem mass spectrometry，HPLC-QTOF-MS/MS） 美國安捷倫公司；UV-1780紫外-可見分光光度計、Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 日本島津公司；定制玻璃層析柱（170 cm×5 cm） 福州昱安正茂玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫果西番蓮果皮的處理

將紫果西番蓮果皮用40 ℃熱風干燥至水分質(zhì)量分數(shù)為（8.0±0.5）%，粉碎后過40 目（0.45 mm）篩，于-18 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫果西番蓮果皮花色苷的提取

稱取100 g樣品與5 L體積分數(shù)60%乙醇溶液（含體積分數(shù)0.1% HCl）于燒杯中混合，保鮮膜封口，于黑暗環(huán)境下提取24 h，（0.097±0.005）MPa減壓抽濾進行固液分離，固體殘渣在上述條件下重復提取3 次，合并濾液。濾液于2 555×g、20 ℃離心10 min，（38±1）℃減壓濃縮（（0.097±0.005）MPa）并回收乙醇，將濃縮液冷凍干燥，即為粗提物。于-18 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 紫果西番蓮果皮花色苷的純化

用蒸餾水將花色苷粗提物配制質(zhì)量濃度為（17.35±0.62）mg/L的溶液。層析柱填料為D101型大孔吸附樹脂，床體積為2 L；上樣流速5 mL/min，泄漏量為10%時停止上樣；先用10 L、pH（2.5±0.05）的HCl溶液以10 mL/min的流速進行洗脫；再用4 L、pH（2.50±0.05）體積分數(shù)90%乙醇溶液以5 mL/min的流速進行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于（38±1）℃下減壓濃縮（（0.097±0.005）MPa），冷凍干燥制得純化樣品。

1.3.4 紫果西番蓮果皮總花色苷含量測定

采用美國分析化學家協(xié)會分析方法中的pH示差法測定紫果西番蓮果皮花色苷粗提物和純化樣品中的總花色苷含量。

1.3.5 HPLC-二極管陣列檢測紫果西番蓮果皮花色苷中C3G的含量

用甲醇配制質(zhì)量溶度為1 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm濾膜待測。色譜條件：色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：體積分數(shù)0.3%甲酸-水溶液，流動相B：乙腈；洗脫梯度：0～10 min、13%～25% B；10～12 min、25%～20% B；12～22 min、20%～13% B；檢測波長520 nm；柱溫25 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；外標法定量。

1.3.6 HPLC-QTOF-MS/MS鑒定紫果西番蓮果皮花色苷組分

色譜條件與1.3.5節(jié)一致。MS條件：正離子模式；霧化器壓力40 psi；干燥器溫度350 ℃；氣體流量10 L/min；毛細管電壓3 500 V；裂解電壓135 V；全掃描；掃描范圍m/z 50～1 200[11]。

1.3.7 紫果西番蓮果皮花色苷體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除活性

參照Brand-Williams等[12]的方法，取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（花色苷粗提物、純化樣品和VC）和3.9 mL 0.063 4 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，避光反應30 min，用紫外-可見分光光度計于515 nm波長處測定溶液吸光度。空白組以3.9 mL無水乙醇溶液代替DPPH溶液。對照組以0.1 mL無水乙醇代替樣品溶液。紫果西番蓮果皮花色苷粗提物和純化樣品DPPH自由基清除率按式（1）計算，并計算DPPH自由基半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

式中：A0為對照組溶液吸光度；A1為樣品組溶液吸光度；A2為空白組溶液吸光度。

1.3.7.2 ABTS陽離子自由基清除活性

參照Re等[13]的方法，將20mL 7 mmol/L的ABTS溶液與350 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，室溫下避光反應14 h，制成ABTS儲備溶液。取15 μL用甲醇配制的不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（花色苷粗提物、純化樣品和VC）與185 μL ABTS儲備溶液混合，避光反應30 min，用紫外-可見分光光度計于734 nm波長處測定溶液吸光度?？瞻捉M以185 μL甲醇溶液代替ABTS儲備溶液，對照組以15 μL甲醇溶液代替樣品溶液。根據(jù)式（1）計算ABTS陽離子自由基清除率，并計算ABTS陽離子自由基IC50。

1.3.7.3 鐵離子還原能力

參照Sarkar等[14]的方法并稍作修改，采用鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定。將300 mmol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖溶液、10 mmol/L二硫蘇糖醇溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混合配制成FRAP溶液。以FeSO4濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y＝0.387 6X+0.184 3（R2＝0.999 6），線性范圍為0.1～1.5 mmol/L。取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（花色苷粗提物、純化樣品和VC）和3.0 mL FRAP溶液混勻，避光反應4 min后于593 nm波長處測定溶液吸光度。將吸光度代入FeSO4標準曲線，將所得相應的FeSO4濃度定義為FRAP，單位為mmol/L。

1.3.8 紫果西番蓮果皮花色苷對α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制作用

1.3.8.1α-淀粉酶活性抑制率

參考文獻[15]中的方法并略作改動。500 μL 1 U/mL的α-淀粉酶溶液與500 μL 1 mg/mL的樣品溶液（花色苷粗提物和純化樣品）混合，37 ℃預熱10 min，加入500 μL 1 g/100 mL可溶性淀粉溶液（預先溶于pH 6.9的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并煮沸15 min），37 ℃孵育3 min，加入1 mL DNS顯色劑，于100 ℃水浴5 min，冷卻后將混合物用超純水稀釋4 倍，于520 nm波長處測定吸光度。以pH 7 PBS代替酶溶液為樣品對照，以pH 7 PBS代替樣品溶液為空白組；以不添加樣品溶液和酶溶液作為空白對照組。按式（2）計算α-淀粉酶活性抑制率。以阿卡波糖為陽性對照，將計算結(jié)果除以阿卡波糖對α-淀粉酶抑制率（測定條件相同），紫果西番蓮果皮花色苷對α-淀粉酶的抑制率以相對于阿卡波糖的抑制率表示。

1.3.8.2α-葡萄糖苷酶活性抑制率

參考Mojica等[16]的方法并稍作修改。在96 孔板中加入50 μL 1 mg/mL樣品溶液和100 μL 1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃孵育10 min；加入50 μL 5 mmol/L的PNPG溶液，37 ℃下孵育5 min，于405 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算抑制率。以阿卡波糖為陽性對照，將計算結(jié)果除以阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率（測定條件相同），紫果西番蓮果皮花色苷對α-葡萄糖苷酶的抑制率以相對于阿卡波糖的抑制率（%）表示。

1.3.9 紫果西番蓮果皮花色苷的體外生物利用度測定

參考Sengul等[17]的方法并略作改動。將20 mg樣品溶解在20 mL pH 1.7的HCl溶液中，加入25.2 mg胃蛋白酶，37 ℃、100 r/min攪拌2 h，再加入500 mg膽汁鹽和18 mg胰蛋白酶進行體外模擬消化。向長5 cm的纖維素透析管（截留分子質(zhì)量12 kDa）中加入5.6 mL 0.75 mol/L NaHCO3溶液，并將其放入消化液中保持2 h。進入管內(nèi)的溶液代表在體內(nèi)吸收并進入血清的樣品，通過pH示差法分析進入血清樣品的總花色苷含量。根據(jù)式（3）計算花色苷的體外生物利用度。

式中：m1為進入透析管內(nèi)溶液中的花色苷質(zhì)量/mg；m2為樣品中花色苷的初始質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗重復3 次，結(jié)果用平均值±標準差表示；采用Graphpad prism 8.0.2軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫果西番蓮果皮中花色苷含量及鑒定

圖1 紫果西番蓮果皮花色苷純化樣品及C3G標準品的HPLC圖Fig. 1 High performance liquid chromatography of purified anthocyanins from Passi flora edulisSims peel and C3G standard

表1 紫果西番蓮果皮花色苷的含量及純度Table 1 Anthocyanin contents and purity of crude and purified anthocyanins from Passi flora edulis Sims peel

紫果西番蓮果皮中花色苷粗提物的得率為（3.94±0.11）mg/g。通過比較純化樣品與C3G標準品的保留時間（圖1），可以初步推斷紫果西番蓮果皮中的主要花色苷為C3G，這與文獻[17]報道的結(jié)果一致。由表1可知，純化樣品中總花色苷含量較粗提物提高了（102.27±1.09）mg/g，回收率為（77.87±0.80）%，C3G純度由（51.17±1.97）%提高到（65.26±2.47）%。由此表明通過D101型大孔樹脂柱層析進行紫果西番蓮果皮花色苷的初步純化是可行的。

圖2 紫果西番蓮果皮花色苷的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of anthocyanins in Passiflora edulis Sims peel

采用HPLC-QTOF-MS/MS對純化樣品中的花色苷組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。誤差質(zhì)量（δ）作為異核多鍵相關譜的一個重要特征，按照δ＜3對化合物結(jié)構(gòu)進行確認[20]，紫果西番蓮果皮中花色苷各組分總離子流圖如圖2所示。理論上，花色苷的糖苷化可以在任意位的羥基上發(fā)生，但是某些羥基位置是被優(yōu)先選擇的，如3-OH和5-OH常被糖基取代，而這兩者相比時，3-OH會優(yōu)先被糖苷化[21]。本實驗從純化樣品中鑒定出12 種花色苷見表2，結(jié)構(gòu)見圖3。

圖2中峰1～4和峰8均有m/z 287的糖苷配基離子，表明它們是矢車菊素的糖苷衍生物。根據(jù)峰1的分子離子峰M+m/z 773.214 03和碎片離子峰m/z 611.161 27/449.104 09/287.054 29，峰1被鑒定為矢車菊素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。根據(jù)峰2的分子離子峰M+m/z 611.161 51和碎片離子峰m/z 449.112 51（損失m/z 162，葡萄糖）/287.055 91（損失m/z 324，2 分子葡萄糖），因此峰2被鑒定為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷，該物質(zhì)已在西番蓮花冠中被報道[22]，但在果皮中鮮見報道。峰3（分子離子峰M+m/z 449.107 56、碎片離子峰m/z 287.054 20）被鑒定為矢車菊素-3-葡萄糖苷。峰4的分子離子峰M+m/z 595.166 40及其碎片離子峰m/z 287.059 20，其損失m/z 308對應于矢車菊素-3-蕓香糖苷中蕓香糖分子（鼠李糖+葡萄糖），因此峰4鑒定為矢車菊素-3-蕓香糖苷。峰3、4所代表物質(zhì)在西番蓮果皮中已見報道[23]。峰8（分子離子峰M+m/z 535.107 50，碎片離子峰m/z 449.106 55/287.054 60）被鑒定為矢車菊素-3-(6”-丙二酰)葡萄糖苷，其在西番蓮果皮[18,24]及花冠[22]中均有報道。

碎片離子峰m/z 271表明該物質(zhì)的糖苷配基為天竺葵素（峰5和峰10）。根據(jù)峰5的分子離子峰M+m/z 433.112 50及碎片離子峰m/z 271.06 090（損失m/z 162，葡萄糖），被鑒定為天竺葵素-3-葡萄糖苷，其在紫果西番蓮果皮中已有報道[18]。峰10具有2 個特征碎片離子峰，分別為m/z 433.112 60（[M]＋-146）和m/z 271.060 81（[M]＋-308），表明糖苷配基與蕓香糖（鼠李糖+葡萄糖）連接。因此，峰10被鑒定為天竺葵素-3-蕓香糖苷。

圖3 紫果西番蓮果皮中花色苷的化學結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structures of anthocyanins in Passiflora edulis Sims peel

根據(jù)峰6和峰12的分子離子峰及碎片離子峰的特征信息，峰6和峰12分別被鑒定為飛燕草素-3-葡萄糖苷和飛燕草素-3-(6”-丙二酰)葡萄糖苷。峰7及峰9的碎片離子峰表明這兩種物質(zhì)均為芍藥素苷（m/z 301）的衍生物。其中峰7的分子離子峰M+m/z 463.124 18，表明其由芍藥素與一分子葡萄糖結(jié)合而成，所以峰7被鑒定為芍藥素-3-葡萄糖苷，其在紫果西番蓮果皮中已見報道[18]。峰9（分子離子峰M+m/z 549.124 21，碎片離子峰m/z 463.124 00/301.068 40）被鑒定為芍藥素-3-(6”-丙二酰)葡萄糖苷。根據(jù)峰11的質(zhì)譜特征信息，其被鑒定為錦葵色素-3-葡萄糖苷，在西番蓮果皮中已見報道[19]。

表2 紫果西番蓮果皮花色苷的鑒定及質(zhì)譜特征Table 2 Identification and mass spectrometric properties of anthocyanins from Passi flora edulis Sims peel

2.2 紫果西番蓮果皮花色苷的體外抗氧化活性

圖4 紫果西番蓮果皮花色苷和VC的DPP自由基（A）、ABTS陽離子自由基（B）清除活性和FRAP（C）Fig. 4 Scavenging activities of anthocyanins from Passi flora edulis Sims peel and VC on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals (A), 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) cation radicals (B) and their ferric ion reducing antioxidant power (C)

由圖4可以看出，在質(zhì)量濃度為50～1 000 μg/mL時，紫果西番蓮果皮花色苷粗提物、純化樣品和VC的DPPH自由基清除率均隨質(zhì)量濃度的增加而增加；質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時，花色苷純化樣品的DPPH自由基清除率略高于VC、顯著高于粗提物（P＜0.05）；花色苷純化樣品、VC和粗提物對DPPH自由基的IC50分別為126.6、152.2 μg/mL和604.1 μg/mL。ABTS陽離子自由基清除率的變化趨勢與之類似，花色苷純化樣品、VC和粗提物的IC50分別為54.47、58.61 μg/mL和260.2 μg/mL。3 種花色苷樣品的FRAP在質(zhì)量濃度5～80 μg/mL范圍內(nèi)呈增加趨勢；在80 μg/mL時，花色苷純化樣品FRAP顯著高于VC和粗提物（P＜0.05），此時FRAP分別為（1.413±0.051）、（1.277±0.025）mmol/mL和（0.724±0.021）mmol/mL。較高的抗氧化能力通常與花色苷及總酚的含量相關[31-32]。研究表明，覆盆子、藍莓中的類黃酮化合物（如花色苷）具有優(yōu)于VC的抗氧化能力[33]，可能是由于花色苷的高抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)中含有大量酚羥基基團有關[21]?？傮w而言，本研究發(fā)現(xiàn)紫果西番蓮果皮花色苷純化樣品的抗氧化能力較粗提物顯著提高，且優(yōu)于VC。

2.3 紫果西番蓮果皮花色苷對α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制作用

表3 紫果西番蓮果皮花色苷對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 3 Inhibition rates of crude extract and purified anthocyanins from Passi flora edulis Sims peel against α-amylase and α-glucosidase

抑制與2型糖尿病相關的關鍵酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）活力能夠減少脂肪吸收和防止餐后血糖升高，是治療2型糖尿病的早期途徑[34]。花色苷通過與這些酶結(jié)合，從而影響其活性。Peng Jinming等[35]發(fā)現(xiàn)，黑花生皮的花色苷提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有濃度依賴性，不同結(jié)構(gòu)的花色苷與酶的結(jié)合能力存在差別。如表3所示，紫果西番蓮果皮花色苷粗提物和純化樣品對α-淀粉酶活力抑制率分別為（26.76±0.98）%和（34.11±1.47）%，對α-葡萄糖苷酶活力抑制率分別為（52.87±2.31）%和（60.36±2.05）%，表現(xiàn)出更強的抑制作用。花色苷純化樣品對兩種酶活力的抑制作用均顯著高于粗提物（P＜0.05）。

紫果西番蓮果皮花色苷粗提物及純化樣品對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用均不及阿卡波糖，然而，一些用于治療肥胖和2型糖尿病的藥物（奧利司他和阿卡波糖）易引發(fā)如胃腸脹氣、腹瀉和腹脹等不良反應，因此常規(guī)藥物與具有生物功效的天然產(chǎn)物聯(lián)用是減輕藥物副作用的新途徑[34]。另一方面，糖尿病人由于血糖升高，糖基化終末期產(chǎn)物和自由基明顯增多，這些自由基會促進炎癥反應發(fā)生，這也是糖尿病慢性病變的一個重要原因，因此抗氧化對于預防和延緩糖尿病的慢性并發(fā)癥具有重要作用[36]。

紫果西番蓮果皮花色苷純化樣品具有很好的抗氧化活性和抑制α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的雙重功效，因此在開發(fā)降血糖功能食品或藥物方面具有極大潛力。

2.4 紫果西番蓮果皮花色苷的體外生物利用度

表4 紫果西番蓮果皮花色苷粗提物和純化樣品的生物利用度Table 4 Bioavailability of crude extract and purified anthocyanins from Passi flora edulis Sims peel

生物利用度是指有效成分被吸收進入人體循環(huán)的比例，描述了口服物由胃腸道吸收以及經(jīng)過肝臟到達體循環(huán)血液中的量占口服劑量的百分比。本實驗采用體外模擬評價紫果西番蓮果皮花色苷的生物利用度，從表4可以看出，花色苷純化樣品的生物利用度為（9.78±0.31）%，顯著大于粗提物的（5.45±0.39）%（P＜0.05）。研究表明，覆盆子花色苷粗提物在腸消化過程中的生物利用度為5.3%[37]，與本研究粗提物體外模擬消化的生物利用度接近。由此可見，紫果西番蓮果皮花色苷純化樣品具有更高的生物利用度。

3 結(jié) 論

基于保留時間和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，初步鑒定出紫果西番蓮果皮中存在12 種花色苷。花色苷純化樣品的抗氧化活性顯著高于粗提物（P＜0.05），且優(yōu)于VC，純化樣品對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用也顯著高于粗提物（P＜0.05），說明花色苷純化樣品具有很好的抗氧化活性和抑制血糖升高的潛能?；ㄉ沾痔嵛锖图兓瘶悠返捏w外生物利用度分別為5.45%和9.78%，純化樣品具有更高的生物利用度。紫果西番蓮果皮花色苷純化樣品在降血糖、抗氧化功能食品和醫(yī)藥方面具有很好的開發(fā)潛力。還需要運用核磁共振波譜等手段進一步解析紫果西番蓮果皮花色苷的組成和結(jié)構(gòu)，進而闡明結(jié)構(gòu)與其強抗氧化性之間的關系，明確花色苷與純化樣品中其他成分可能存在的協(xié)同增效作用。