一株側(cè)耳屬野生菌的分離鑒定及初步馴化栽培

晚安琪，藺曉云，黃亮，班立桐，孫寧，王玉，李奕葶

一株側(cè)耳屬野生菌的分離鑒定及初步馴化栽培

晚安琪，藺曉云，黃亮通信作者，班立桐，孫寧，王玉，李奕葶

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

從天津?qū)氎鎱^(qū)采集了一株野生真菌，對其進行分離鑒定。通過提取供試野生菌株的基因組，對其18S rDNA序列進行了擴增、測序，將所測的基因序列提交到GeneBank中進行 BLAST 比對，選取相似性較高的菌株，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹。利用18S rDNA序列分析法與傳統(tǒng)分類法相結(jié)合的方法，鑒定出該野生真菌屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（），為平菇菌株。進一步采用瓶栽技術(shù)馴化栽培子實體獲得成功，平均有效生物學(xué)轉(zhuǎn)化率可達(dá)50.4%。

平菇；18S rDNA鑒定；系統(tǒng)進化樹；馴化栽培

平菇（）學(xué)名側(cè)耳，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），是我國栽培面積最大的食用菌[1-2]。其野生菌株生長在春秋季節(jié)闊葉樹林的枯木上，生長溫度范圍寬泛，在我國大部分地區(qū)均有分布[3]。平菇營養(yǎng)豐富、口味鮮美，具有多種藥理活性及臨床功效，是食藥兩用菌，具有廣闊的消費市場及開發(fā)前景[4-9]。平菇在20世紀(jì)30年代即實現(xiàn)了人工栽培，目前在許多國家均有栽培，我國平菇栽培量居世界第一位。平菇瓶栽工廠化生產(chǎn)可實現(xiàn)四季栽培，有望替代傳統(tǒng)塑料袋栽培，而一潮菇產(chǎn)量較高的菌株，將有利于提高設(shè)備及廠房的利用率。

作者于天津市林木種苗示范基地的馬家店槐樹枯死樹上采集到疑似野生平菇，通過組織分離獲得該野生真菌的菌絲培養(yǎng)物，進一步提取子實體及菌絲體的基因組DNA，進行18S片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定種屬后進行初步瓶栽馴化栽培。本研究將為該野生平菇的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)，也將促進天津市食用菌種質(zhì)資源庫的建設(shè)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試野生菌株樣品于2017年采集于天津市林木種苗示范基地馬家店槐樹枯死樹上，利用組織分離法獲得斜面菌絲體，命名為TN02。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

栽培料配方：棉籽殼45%、木屑45%、麩皮9%、石灰1%，加水?dāng)嚢柚梁?5%。

1.1.3 引物

采用真菌鑒定通用引物擴增18S rDNA序列。NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’），NS6 （5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’）。

1.2 試驗方法

1.2.1 子實體形態(tài)特征觀察

對供試子實體生長環(huán)境及其形態(tài)、顏色特征進行觀察、拍照，并結(jié)合相關(guān)文獻，初步鑒定其科分類地位。

1.2.2 菌絲DNA提取及PCR擴增

按照Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒說明書進行菌絲DNA提取，PCR擴增后用pMD?18-T Vector 連接試劑盒進行克隆測序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測定的18S rDNA 序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，查找同源相似性高的序列，利用MEG7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 平菇馴化栽培

采用850 mL培養(yǎng)瓶進行馴化栽培，每瓶干料質(zhì)量約175 g。菌瓶長滿后，轉(zhuǎn)至岀菇室開蓋直立培養(yǎng)，出菇溫度15～18 ℃，空氣相對濕度85%～90%，每24 h照明12 h，只采收第1茬鮮菇并計算產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實體生態(tài)環(huán)境調(diào)查及形態(tài)鑒定

供試野生真菌樣品TN02采集于天津市寶坻區(qū)林木種苗示范基地，形態(tài)特征如圖1所示。由圖1可見，子實體疊生，菌蓋呈扇狀，灰色至褐色，直徑2～7 cm，最大11 cm，厚度0.3～0.8 cm；菌褶致密，延生不分叉；菌柄側(cè)生，白色，內(nèi)實，基部有少量絨毛，初步鑒定其為側(cè)耳屬。

圖1 野生真菌TN02子實體的形態(tài)照片

注：a. 野生狀態(tài)；b. 子實體正面；c. 子實體反面

2.2 菌絲DNA提取及PCR擴增

將提取的菌株基因組DNA片段經(jīng)電泳檢測后在凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察其基因組DNA電泳圖譜呈單一清晰的條帶（圖未列出）。以NS1、NS6 為引物對基因進行擴增，電泳后出現(xiàn)了清晰明亮的單一條帶，結(jié)果如圖2所示，所得產(chǎn)物片段大小為1 200～1 500 bp。

圖2 PCR擴增18S rDNA序列產(chǎn)物電泳圖

注：M為Marker；P為PCR產(chǎn)物

2.3 TN02平菇系統(tǒng)進化分析

將PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，得到的序列長度為1 321 bp，在GenBank中的登錄號為MN068914。進一步進行系統(tǒng)進化分析，獲得進化樹，見圖3。

圖3 TN02平菇18S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

從進化樹（圖3）可以看出，TN02與FJ379284.1的基因片段相似度達(dá)99%，遺傳距離最近；形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果和BLAST比對結(jié)果一致，鑒定菌株TN02為平菇（）。

2.4 菌絲體培養(yǎng)及馴化栽培

將組織分離的TN02菌株進行平板培養(yǎng)，14 d左右即鋪滿平板，菌絲生長速度為0.66 cm/d。對6瓶岀菇后的子實體農(nóng)藝性狀進行了調(diào)查，結(jié)果 見表1。

表1 TN02子實體農(nóng)藝性狀

由表1可見，出菇試驗均獲得了子實體，但整齊度不高。第5瓶和第6瓶由于岀菇個數(shù)較少，導(dǎo)致最終產(chǎn)量偏低（圖4）。以第1～第4瓶為有效岀菇瓶，平均生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為50.4%，相當(dāng)于康源春等[10]研究中的平菇七至八成熟的水平。由于本試驗中裝料位置距瓶口3～4 cm，子實體在生長期間所處微環(huán)境的CO2體積分?jǐn)?shù)偏高，獲得的平菇菌柄偏長（平均11.6 cm）。人工栽培的子實體形態(tài)與野生子實體形態(tài)差別很大，表明該平菇菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)能力，也說明環(huán)境控制是改變子實體農(nóng)藝性狀的重要手段。

注：a. 岀菇培養(yǎng)14 d；b. 岀菇培養(yǎng)16 d；c. 第2瓶子實體；d. 第5瓶子實體

3 討論與結(jié)論

編碼rDNA的序列分析可用于未知微生物的鑒定或者對表型鑒定結(jié)果進行驗證，應(yīng)用非常廣泛[11-13]。18S rDNA序列高度保守，常用來分析物種系統(tǒng)進化關(guān)系，具有很好的通用性，在GeneBank中數(shù)據(jù)源豐富，利用其鑒別菌株在一定范圍內(nèi)更具準(zhǔn)確性。

綜合菌株的生態(tài)環(huán)境及其形態(tài)特征，再根據(jù)18S rDNA序列比對結(jié)果，參照系統(tǒng)進化樹可鑒定出該野生真菌屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycota），傘菌目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（），為平菇菌株。經(jīng)初步馴化栽培可知，該平菇菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)能力，瓶栽平均有效生物學(xué)轉(zhuǎn)化率可達(dá)50.4%，具有進一步人工栽培馴化的潛力。菌種質(zhì)量是影響食用菌生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[14]。平菇為大眾菇種，天津市主栽品種大多來源于南方，品質(zhì)參差不齊，菇農(nóng)對平菇的管理大多依靠經(jīng)驗；天津存在眾多的菌菇資源可以開發(fā)利用（如葦蘑[15]）。本研究從當(dāng)?shù)胤蛛x到的菌株培養(yǎng)溫度為15 ℃左右，適合北方氣候特點，且生長速度較快，管理簡單，馴化后有較好的推廣價值。

[1] 朱彩平，孫靜儒，孫紅霞，等. 平菇微波-真空冷凍聯(lián)合干燥工藝優(yōu)化及其品質(zhì)分析[J]. 現(xiàn)代食品科技，2019，35（6）：129-138.

[2] 趙光輝，方洪楓，陳劍，等. 平菇栽培技術(shù)發(fā)展與栽培原料消毒、滅菌技術(shù)的創(chuàng)新[J]. 食藥用菌，2019，27（2）：122-124.

[3] 宋冰，付永平，郭昱秀，等. 一株野生側(cè)耳屬菌株的鑒定及生物學(xué)特性[J]. 北方園藝，2017（24）：182-188.

[4] 朱彩平，翟希川，張曉，等. 平菇多糖提取分離純化及生物活性的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（6）：359-364，369.

[5] Xia F，F(xiàn)an J，Zhu M，et al. Antioxidant effects of a water-soluble proteoglycan isolated from the fruiting bodies of[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2011，42（3）：402-407.

[6] Younis A M，Wu F S，El Shikh H H. Antimicrobial activity of extracts of the oyster culinary medicinal mushroom（higher Basidiomycetes）and identification of a new antimicrobial compound[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms，2015，17（6）：579-590.

[7] Ravi B，Renitta R E，Prabha M L，et al. Evaluation of antidiabetic potential of oyster mushroom （）in alloxan-induced diabetic mice[J]. Immunotoxicol，2013，35（1）：101-109.

[8] Krishnamoorthy D，Sankaran M. Modulatory effect ofon oxidant/antioxidant status in 7，12- dimethylbenz（a）anthracene induced mammary carcinoma in experimental rats-A dose-response study[J]. Journal of Cancer Research &Therapeutics，2016，12（1）：386-394.

[9] 崔成偉，王翠翠，龍瑞，等. 平菇化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（13）：304-309.

[10] 康源春，袁瑞奇，孔維麗，等. 平菇瓶栽工廠化生產(chǎn)子實體不同成熟度采收對產(chǎn)量、質(zhì)量的影響和經(jīng)濟性評價[J]. 中國食用菌，2019，8（1）：32-34.

[11] 朱洪慶，王盼盼，張萌，等. rDNA-ITS序列分析法與傳統(tǒng)分類法相結(jié)合在真菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 西華師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，37（3）：264-269.

[12] 邱志偉，陳有忠，于奧安，等. 棗樹根部內(nèi)生細(xì)菌的分離及對3種棗病原真菌拮抗活性研究[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2019，26（3）：12-16.

[13] 孫曉莉，高建，潘樂欣，等. 豬大腸桿菌性腹瀉病的病原分離鑒定及藥敏試驗[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2019，26（2）：57-60.

[14] 孫寧，班立桐，黃亮，等. 杏鮑菇不同菌種類型生產(chǎn)性能的比較試驗[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2019，26（2）：43-45.

[15] 李春霞，楊紅澎，黃亮，等. 葦蘑子實體提取物的抗輻射作用及抗氧化活性[J]. 食用菌學(xué)報，2019，26（2）：83-87.

Identification and cultivation of a wild

WAN An-qi,LIN Xiao-yun, HUANG LiangCorresponding Author, BAN Li-tong, SUN Ning, WANG Yu,LI Yi-ting

（College of Agronomy and Resources Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The object of this paper was to isolate and identify a wild fungus which was obtained from Baodi district, Tianjin city. The genomic DNA of the wild fungus was extracted and used as templates for the 18S rDNA gene PCR amplification. The 18S rDNA gene fragments were sequenced later. Multiple sequence alignmentwas operated by BLAST in GeneBank. Then other known species with high homology were used for the phylogenetic tree construction. By the 18S rDNA sequence analysis combined with morphological classification,results showed that the fungus belonged to the Basidiomycetes, Agaricales, Pleurotaceae,. The fruiting body was cultivated successfully and the average biological efficiency of the first harvest was 50.4%.

; 18S rDNA; phylogenetic trees; artificial cultivation

1008-5394（2020）02-0028-03

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.006

S646

A

2019-11-24

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201810061121）；天津市蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（ITTVRS 2017015）

晚安琪（1998-），女，本科在讀，研究方向為菌類作物。E-mail：920720136@qq.com。

黃亮（1983-），男，副教授，博士，主要從事生物發(fā)酵及食用菌栽培。E-mail：huangliang@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：宗淑萍