紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的條件優(yōu)化及功效活性的初步檢測(cè)

李月嬋，張子祎，魏學(xué)源，常莉，楊薇

紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的條件優(yōu)化及功效活性的初步檢測(cè)

李月嬋，張子祎，魏學(xué)源，常莉，楊薇通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多糖的培養(yǎng)基組成及工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵多糖的提取純化及其抗氧化性、抑菌性進(jìn)行了初步研究。在由40 mg/mL大米粉、10 mg/mL大豆粉、0.15 mg/mL KCl、0.15 mg/mL KH2PO4、0.15 mg/mL NaCl組成的培養(yǎng)基中液態(tài)發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基保持初始pH值，溫度為32 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。在此條件下，紅曲霉搖瓶液態(tài)發(fā)酵的多糖質(zhì)量濃度達(dá)到142.3 mg/mL，是優(yōu)化前的1.3倍左右。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅曲霉胞外多糖清除DPPH自由基能力較好，清除羥自由基的能力較弱；且紅曲多糖對(duì)大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌有一定的抑菌效果，但對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌性。

紅曲霉胞外多糖；條件優(yōu)化；多糖的提取；抗氧化性；抑菌性

紅曲霉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥紅曲的基原菌，是一種嗜酸的小型絲狀腐生真菌[1]，據(jù)《本草綱目》記載，紅曲具有消食、化瘀等療效，是“藥食同源”的典型代表[2]。近年來(lái)，紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物逐漸成為研究焦點(diǎn)，其降壓、降脂、抑菌和抗腫瘤的功效也逐步被開(kāi)發(fā)利用。我國(guó)對(duì)紅曲霉菌的研究大多集中在色素、膽固醇抑制劑及洛伐他汀等方面，但對(duì)紅曲霉胞外多糖的生物活性及高產(chǎn)紅曲多糖的發(fā)酵條件等方面研究較少[3-4]。因此，本研究以紅曲霉作為生產(chǎn)菌株，以大米粉為培養(yǎng)基的主要基質(zhì)進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，將發(fā)酵液中胞外多糖的含量為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行一系列優(yōu)化，從而篩選出高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件，基于上述條件液態(tài)發(fā)酵紅曲霉后，對(duì)分離出的紅曲多糖粗提物進(jìn)行抗氧化性和抑菌能力的檢測(cè)，以期為紅曲霉胞外多糖的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

紅曲霉，由江南大學(xué)提供。

1.1.2 發(fā)酵原料

市售東北優(yōu)質(zhì)大米、大豆粉。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：向250 mL三角瓶中加入100 mL麥芽汁制成麥芽汁液態(tài)培養(yǎng)基，115 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后加入1 mL孢子懸浮液（孢子濃度為2.25×106個(gè)/mL），并置于搖床中以32 ℃ 160 r/min的條件培養(yǎng)72 h，取出待接菌備用。

大米培養(yǎng)基：將新鮮大米粉碎成細(xì)粉后，按照表1配比加入250 mL三角瓶中，在121 ℃下滅菌30 min，冷卻至室溫后備用。

表1 大米培養(yǎng)基

組分添加量 大米粉/g4 大豆粉/g1 KCl/g0.015 KH2PO4/g0.015 NaCl/g0.015 蒸餾水/mL100

LB培養(yǎng)基：將瓊脂、蛋白胨等原料，按照表2配比加入250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)pH至7.5，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后備用。

表2 LB培養(yǎng)基

組分添加量 瓊脂/g2 蛋白胨/g1 酵母浸出汁/g0.5 NaCl/g1 蒸餾水/mL100

1.1.4 試劑

蛋白胨、酵母浸出液、瓊脂粉、葡萄糖、苯酚、抗壞血酸（維生素C）、硫酸、氯化鈉、二苯代苦味酰基自由基（DPPH?）、雙氧水、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、乳酸、異戊醇、氯仿、氯化鉀、乙醇、甘露醇，以上試劑均為分析純，由天津農(nóng)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

試驗(yàn)證明，以4 g大米粉、1 g大豆粉、0.015 g KCl、0.015 g KH2PO4、0.015 g NaCl和100 mL蒸餾水配置的大米培養(yǎng)基為高產(chǎn)紅曲霉胞外多糖的液態(tài)培養(yǎng)基，對(duì)紅曲霉進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵120 h，發(fā)酵液中胞外多糖的平均質(zhì)量濃度為112.3 mg/mL[5]。因此，在大米培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以1 mL接種量、32 ℃和160 r/min的初始條件，將紅曲霉液態(tài)發(fā)酵120 h，用苯酚-硫酸法測(cè)定出發(fā)酵液中多糖的質(zhì)量濃度作為篩選指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。

1.2.1.1 發(fā)酵液中多糖含量的檢測(cè)

用天平稱取一定量的葡萄糖放入容量瓶中定容，分別量取定容后的溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至新的容量瓶中再次定容，記錄各個(gè)葡萄糖稀釋液質(zhì)量濃度。各取2.0 mL定容后的稀釋液，再取2 mL蒸餾水，分別標(biāo)號(hào)為1～6，6為空白對(duì)照。將6份溶液分別加入5%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置20 min，在490 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度。以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取待測(cè)紅曲霉發(fā)酵液15 mL，4 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液定容至100 mL混勻制成稀釋液。取1 mL稀釋液于試管中，加入1 mL蒸餾水，采用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液490 nm下的吸光值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.1.2 發(fā)酵液pH的優(yōu)化

在大米培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵至48 h時(shí)暫停發(fā)酵，以乳酸來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH分別為3.0、4.0和5.0，每個(gè)pH值各作3組平行試驗(yàn)，后繼續(xù)發(fā)酵至120 h。檢測(cè)不同pH值發(fā)酵液中紅曲霉胞外多糖的質(zhì)量濃度，取其平均值。

1.2.1.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

在大米培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)培養(yǎng)溫度分別為24、28、32和36 ℃，每個(gè)溫度作3組平行試驗(yàn)，在160 r/min下液態(tài)發(fā)酵120 h，測(cè)定發(fā)酵液中多糖的質(zhì)量濃度，取其平均值。

1.2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

在大米培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為120、140、160和180 r/min，每個(gè)轉(zhuǎn)速作3組平行試驗(yàn)，在最佳溫度下液態(tài)發(fā)酵120 h，測(cè)定發(fā)酵液中多糖的質(zhì)量濃度，取其平均值。

1.2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

以通過(guò)1.2.1.2～1.2.1.4試驗(yàn)篩選所得液態(tài)發(fā)酵條件，重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.2 紅曲霉胞外多糖的分離提取

將發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，按1 mL/L的比例添加正丁醇，60 ℃下濃縮至原體積的1/5。在得到的濃縮液中加入4倍體積的95 %乙醇，靜置并離心10 min，棄上清液得粗多糖沉淀，于60 ℃干燥箱中烘干直至恒重。用20倍體積的去離子水溶解該沉淀，以4 000 r/min離心10 min取上清液進(jìn)行脫蛋白處理。待加入1/5體積的氯仿-異戊醇試劑后（氯仿∶異戊醇＝24∶1），在通風(fēng)、避光條件下攪拌30 min、靜置30 min再取上清液，棄變性蛋白及有機(jī)溶劑。重復(fù)上述操作，直至有機(jī)溶劑與多糖溶液層之間無(wú)變性蛋白為止。冷凍干燥多糖溶液，即得紅曲多糖粗提物。

1.2.3 紅曲多糖的抗氧化性

1.2.3.1 紅曲多糖清除DPPH自由基的能力

取紅曲多糖粗提物，配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的粗多糖溶液于試管中，每個(gè)質(zhì)量濃度做3組平行。將1.0 mL多糖稀釋液與1.0 mL DPPH以及4.0 mL蒸餾水加入同一試管中，搖勻，避光靜置30 min，并在517 nm處測(cè)量其吸光值。以相同質(zhì)量濃度的維生素C做陽(yáng)性對(duì)照，按公式（1）計(jì)算其清除率[6-8]：

DPPH清除率＝[1－（X－X0）]/0×100% （1）

其中，X：1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品＋1.0 mL DPPH＋4.0 mL蒸餾水

0：1.0 mL DPPH＋5.0 mL蒸餾水

X0：6.0 mL無(wú)水乙醇

1.2.3.2 紅曲多糖清除羥自由基的能力

取紅曲多糖粗提物，配制與上述相同質(zhì)量濃度的粗多糖溶液于試管中，每個(gè)質(zhì)量濃度作3組平行試驗(yàn)。將2.0 mL多糖稀釋液與2 mL FeSO4、 2 mL水楊酸-乙醇溶液以及2 mL H2O2溶液于同一試管中，混合搖勻，37 ℃反應(yīng)30 min，并在510 nm處測(cè)量其吸光值。以相同質(zhì)量濃度的甘露醇做陽(yáng)性對(duì)照，按公式（2）計(jì)算其清除率[9-12]：

OH清除率＝[1－（X－X0）]/0×100% （2）

其中，0：2 mL蒸餾水＋2 mL FeSO4＋2 mL水楊酸-乙醇溶液＋2 mL H2O2

X：2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品＋2 mL FeSO4＋2 mL水楊酸-乙醇溶液＋2 mL H2O2

X0：2 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品＋2 mL FeSO4＋2 mL水楊酸-乙醇溶液＋2 mL水

1.2.4 紅曲多糖的抑菌性

制備雙層平板，使后續(xù)所有的抑菌圈幾乎都位于同一平面上，更易于觀察[13]。首先將下層LB培養(yǎng)基融化，每皿約10 mL，倒平板，凝固后待用，再將上層LB培養(yǎng)基融化，待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃時(shí)，將菌液倒入上層培養(yǎng)基中混勻，迅速倒平板，每皿約10 mL，冷卻凝固[14-15]。用滅菌鑷子夾住均勻浸泡多糖稀釋液濾紙片，置于上層培養(yǎng)基上，每皿放3組平行試驗(yàn)，并用浸泡無(wú)菌水的濾紙片作空白對(duì)照。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察濾紙片周圍有無(wú)抑菌環(huán)出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚-硫酸法檢測(cè)發(fā)酵液中紅曲多糖的質(zhì)量濃度需用到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在490 nm下，以稀釋液的吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程＝9.818 2，且2＞0.994 5，如圖1所示。說(shuō)明此標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，該測(cè)定方法具有可信度。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 發(fā)酵液pH優(yōu)化

多糖的合成是在多種酶共同催化下完成的，pH值可影響酶的催化過(guò)程，改變體系酶的反應(yīng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝流，從而對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和多糖積累產(chǎn)生較大影響。

由圖2可知，pH值過(guò)低不利于多糖的積累。在保持自然pH值條件下，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基中紅曲多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到110.8 mg/mL。

圖2 pH值對(duì)多糖產(chǎn)量的影響

2.1.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

多糖的合成離不開(kāi)多酶體系的共同催化，溫度可影響酶的活性。溫度過(guò)高，酶易變性失活，溫度過(guò)低則酶活降低，直接影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝流，從而對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)和多糖積累產(chǎn)生較大影響。由圖3可知，在保持初始pH值條件下，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，紅曲多糖產(chǎn)量最高，為112.1 mg/mL。

圖3 溫度對(duì)多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

轉(zhuǎn)速不僅影響紅曲霉菌絲體生長(zhǎng)與孢子生成，而且影響其次生代謝物的產(chǎn)量，通過(guò)最優(yōu)轉(zhuǎn)速提供的通氣量能最大限度地滿足紅曲霉的生長(zhǎng)需求。轉(zhuǎn)速太低，培養(yǎng)液的溶氧率不能滿足菌絲與孢子生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速太高，雖然培養(yǎng)液的通氣得到改善，但過(guò)高的震蕩速率會(huì)加快菌絲體的自溶，對(duì)菌絲產(chǎn)生一定的剪切作用，不利于胞外多糖的生成。此外，轉(zhuǎn)速過(guò)高也會(huì)增加試驗(yàn)成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在不同轉(zhuǎn)速下液態(tài)發(fā)酵120 h，測(cè)定發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量，結(jié)果如圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在一定范圍內(nèi)增加轉(zhuǎn)速，可使紅曲多糖的產(chǎn)量也相應(yīng)提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，為143.6 mg/mL。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)多糖產(chǎn)量的影響

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在大米培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，同時(shí)保持發(fā)酵液自然pH、溫度32 ℃和轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下，對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵120 h，測(cè)定發(fā)酵液中胞外多糖的質(zhì)量濃度，并重復(fù)3次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組多糖產(chǎn)量/mg·mL-1 1149.8 2137.2 3139.9 平均值142.3

通過(guò)3次驗(yàn)證試驗(yàn)可知，發(fā)酵條件優(yōu)化后對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵120 h，發(fā)酵液中胞外多糖平均產(chǎn)量為142.3 mg/mL，是未優(yōu)化前液態(tài)發(fā)酵多糖產(chǎn)量的1.3倍。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更利于發(fā)酵過(guò)程中胞外多糖的生成和積累，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 紅曲多糖的抗氧化性試驗(yàn)

2.2.1 清除DPPH自由基

在大米培養(yǎng)基以及優(yōu)化條件下培養(yǎng)120 h，經(jīng)分離得到紅曲多糖的粗提物，用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的多糖稀釋液。由于紫外分光光度計(jì)較靈敏，若質(zhì)量濃度過(guò)大導(dǎo)致吸光值過(guò)大，試驗(yàn)誤差較大，因此，配制稀釋液的質(zhì)量濃度應(yīng)不大于0.10 mg/mL，并以維生素C作對(duì)照進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn)，結(jié)果如圖5。

圖5 紅曲霉胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

由圖5可見(jiàn)，紅曲霉經(jīng)液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的胞外多糖對(duì)DPPH自由基具有較好的清除作用，但其清除率小于相同質(zhì)量濃度的維生素C。在試驗(yàn)所取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅曲多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，清除率為79.5 %。

2.2.2 清除羥自由基

將分離得到的紅曲多糖粗提物用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的多糖稀釋液，稀釋液質(zhì)量濃度不大于0.10 mg/mL，并與甘露醇作對(duì)照進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn)，結(jié)果如圖6。

圖6 紅曲霉胞外多糖對(duì)羥自由基的清除率

由圖6可知，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)羥自由基具有較好的清除作用，清除率高于相同質(zhì)量濃度的甘露醇。在試驗(yàn)所取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅曲多糖對(duì)羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大，為44.16 %。

2.3 紅曲多糖的抑菌試驗(yàn)

將分離得到的紅曲多糖粗提物，用蒸餾水稀釋成一定質(zhì)量濃度的多糖稀釋液，與蒸餾水相對(duì)照進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。由圖7～圖9可見(jiàn)，大腸桿菌上層培養(yǎng)基的濾紙片周圍存在抑菌圈，說(shuō)明紅曲霉胞外多糖對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用；枯草芽孢桿菌上層培養(yǎng)基的濾紙片周圍沒(méi)有明顯抑菌圈，說(shuō)明紅曲多糖對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)抑制作用；產(chǎn)氣桿菌上層培養(yǎng)基的濾紙片周圍存在抑菌圈，說(shuō)明紅曲霉胞外多糖對(duì)產(chǎn)氣桿菌有一定的抑制作用。

圖7 紅曲多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌試驗(yàn)

注：每皿左上角為空白對(duì)照。下同

圖8 紅曲多糖對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌試驗(yàn)

圖9 紅曲多糖對(duì)產(chǎn)氣桿菌的抑菌試驗(yàn)

3 結(jié)論

在對(duì)紅曲霉進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的初步研究中，確定以原始pH的發(fā)酵液、培養(yǎng)溫度為32 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min作為發(fā)酵條件，比較適合紅曲胞外多糖的代謝和積累。基于該條件下，對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵120 h，發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)142.3 mg/mL，較未優(yōu)化時(shí)多糖產(chǎn)量提高了約27 %，可見(jiàn)優(yōu)化后的條件更有利于紅曲霉胞外多糖的生成和積累。對(duì)上述發(fā)酵液中多糖進(jìn)行分離提取，進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn)可知，紅曲多糖對(duì)DPPH自由基和羥自由基均有清除能力，其中對(duì)羥自由基的清除能力更顯著，表現(xiàn)出良好的抗氧化性，且紅曲多糖能夠抑制大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的生長(zhǎng)，但對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有任何抑制 作用。

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Optimization of conditions for the production of exopolysaccharides byand preliminary detection of efficacy activity

LI Yue-chan, ZHANG Zi-yi, WEI Xue-yuan, CHANG Li, YANG WeiCorresponding Author

（College of Basic Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this paper, the medium composition and process conditions of polysaccharides produced by liquid fermentation ofwere optimized, and the extraction, purification, antioxidation and antibacterial activities of liquid fermentation polysaccharides fromwere studied. Under the liquid fermentation of a medium consisting of 40 mg/mL rice flour, 10 mg/mL soybean powder, 0.15 mg/mL KCl, 0.15 mg/mL KH2PO4, 0.15 mg/mL NaCl, optimized by single factor experiment,the fermentation process conditions are as follows: the fermentation medium maintains an initial pH value of 32℃and a rotational speed of 180 r/min. Under this condition, the mass concentration of polysaccharides in the liquid fermentation ofshake flask reached 142.3 mg/mL, which was about 1.3 times that before optimization. The preliminary detection of the antioxidant activity of the extractedpolysaccharides showed that theexopolysaccharide scavenged DPPH free radicals better, and the ability to scavenge hydroxyl radicals was weak. Moreover,polysaccharide had a certain antibacterial effect onand, but had no antibacterial activity against.

extracellular polysaccharide; condition optimization; polysaccharide extraction; antioxidant; bacteriostatic

1008-5394（2020）02-0079-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.017

Q93

A

2019-08-26

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710061216）

李月嬋（1997-），女，碩士在讀，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：1390675929@qq.com。

楊薇（1981-），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c生物制藥。E-mail：yangwei811127@126.com。

責(zé)任編輯：宗淑萍