漢族人群中男性勃起功能障礙與色氨酸羥化酶2基因多態(tài)性的關(guān)系

付 旭，張賢生

勃起功能障礙(erectile dysfunction ,ED)定義為持續(xù)或經(jīng)常無法達到和/或維持陰莖勃起足以使性滿意，包括令人滿意的性行為的陰莖勃起，被認為是血管、神經(jīng)源性、結(jié)構(gòu)性、激素性、精神性疾病或由藥物、創(chuàng)傷引起的疾病，損害了患者的社會心理健康和生活質(zhì)量。近期有研究[1]提示中國ED發(fā)病率為41.6%，性焦慮影響9%～25%的男性，并導(dǎo)致早泄和心因性ED[2]。色氨酸羥化酶2基因(tryptophan hydroxylase 2 ,TPH2)基因是中樞 5-HT 合成中的限速酶，其濃度及活性影響5-HT 的合成，TPH2 基因多態(tài)性影響其表達水平，進而調(diào)控中樞 5-HT 水平[3]。目前TPH2基因的研究主要集中于精神疾病領(lǐng)域，被認為在包括抑郁癥在內(nèi)的許多精神疾病中起著重要作用，但還沒有關(guān)于TPH2基因多態(tài)性對ED影響的研究。該研究探究了該基因的3′UTR、5′UTR、編碼區(qū)和交界區(qū)的多態(tài)性與ED的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科招募59例確診為ED的男性，年齡22～58 (30.59±5.49)歲；另從健康檢查中心招募151例健康對照者，年齡21～48(30.52±6.38)歲，采集他們的外周血樣本，并抽提基因組DNA保存?zhèn)溆?。入選標(biāo)準(zhǔn)如下：在21歲以上的年齡中，與同一個女性伴侶保持穩(wěn)定關(guān)系，并嘗試至少6次，國際勃起功能指數(shù)(international index of erectile function-5 ,IIEF-5)≤21。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：脊柱損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病史，生殖器外傷史或陰莖畸形；合并其他性功能障礙；性伴侶存在性功能障礙。提供參與研究的書面知情同意書。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 TPH2基因測序及統(tǒng)計分析

1.2.1TPH2基因測序 測序區(qū)域包括TPH2基因的完整編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)。調(diào)控基因組區(qū)域包括5′非翻譯區(qū)(5′UTR)、3′非翻譯區(qū)(3′UTR)和15 bp外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)。利用primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)軟件設(shè)計TPH2基因靶區(qū)的特異性引物，用ABI 2720熱循環(huán)儀(ABI2720，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進行擴增反應(yīng)。所有PCR產(chǎn)物均由上海天昊生物科技公司采用Illumina HiSeq測序儀(Hiseq，美國億明達公司)2×150雙端測序模式進行高通量測序分析。

1.2.2生物信息學(xué)及統(tǒng)計分析 使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/FastQC/)對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行評估，使用Burrows-Wheeler校準(zhǔn)工具v0.7.15-r1140(http://bio bwa.sourceforge.net/)將序列比對到人類基因組參考序列(UCSC hg19)，生成BAM校準(zhǔn)文件。使用Picard v2.2.1軟件刪除重復(fù)序列(https://broadinstitute.github.io/picard/)，只有測序深度大于10X的堿基才能進行后續(xù)分析，使用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/GATK/)和VarScan v2.3.9軟件(http://VarScan.sourceforge.net/)對每個樣本進行基因變異檢測，使用ANNOVAR軟件包(http://ANNOVAR.openbioinformiscs.org/en/latest/)對單核苷酸變異(single nucleotide variants,SNV)進行功能注釋，利用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster軟件進行非同義和剪接位點變體的生物功能預(yù)測分析。連續(xù)變量和分類變量分別用SPSS(22.0版)進行t檢驗和非參數(shù)Krukcal-Wallis檢驗。常見單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(MAF>0.05)采用Plink軟件(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/)進行Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗及病例對照間的基因頻率差異分析，利用logistic回歸分析計算優(yōu)勢比(OR)和95%CI，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析樣本詳細的人口統(tǒng)計學(xué)特征見表1。IIEF-5評分在ED組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。早泄診斷工具(premature ejaculation diagnostic tool ,PEDT)評分是評價射精功能的主觀指標(biāo)，ED組PEDT與對照組無明顯差異(P=0.088)。年齡、體質(zhì)指數(shù)以及教育程度均無明顯差異。

2.2 TPH2基因多態(tài)性統(tǒng)計分析210個DNA樣本成功進行了基因測序，共得到6個最小等位基因頻率MAF>0.05的SNP位點數(shù)據(jù)，SNP位點詳細信息見表2。在校正了年齡、婚姻狀況、身體質(zhì)量指數(shù)和教育程度后，rs11178998、rs7305115、SNV019、rs17110747位點的基因型分布及等位基因頻率在ED組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 對照組與ED組臨床資料分析

rs1007023是位于內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)多態(tài)性，G等位基因頻率在ED患者中高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)，見表3。ED組和對照組在不同遺傳模型下分析，顯示rs1007023在顯性模型下，G/G+T/G等位基因型分布在ED組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)，提示rs1007023的G/G+T/G等位基因患ED可能性較大，見表4。

3 討論

Kulikova et al[4]通過使動物暴露在壓力下來產(chǎn)生抑郁大鼠模型，抑郁大鼠大腦TPH2的表達明顯低于健康大鼠，應(yīng)激可抑制TPH2在腦組織中的表達，降低5-HT的濃度，其機制可能與TPH2基因啟動子的甲基化增加有關(guān)。Wigner et al[5]研究表明TPH2基因-1449C>A位點與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)，C等位基因降低抑郁障礙發(fā)展的風(fēng)險，支持了該通路參與抑郁癥發(fā)病機制的假說。除此之外，ED嚴重程度與25(OH)D呈正相關(guān)[6]，低水平的維生素D可能通過促進內(nèi)皮功能障礙而增加ED的風(fēng)險，患有ED的男性應(yīng)該進行維生素D水平的分析，對于低維生素的ED患者，建議補充維生素D[7]。維生素D激活大腦中一個VDRE處的TPH2的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)大腦TPH2的表達，從而選擇性地增強中樞血清素[8]。如前所述，多種精神心理疾病影響甚至導(dǎo)致ED的發(fā)生，而TPH2被認為包括抑郁癥在內(nèi)的許多精神疾病中起著重要作用，因此TPH2可能與男性勃起功能相關(guān)，而本實驗結(jié)果證實了ED與TPH2多態(tài)性相關(guān)，顯示TPH2的SNP rs1007023中G等位基因可能為勃起功能障礙的危險性因素。rs1007023位點位于TPH2基因8號內(nèi)含子，在RegulomeDB (http://regulomedb.org)數(shù)據(jù)庫中查詢，rs1007023位點的RegulomeDB score為5，這個評分說明rs1007023可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系不大。因此課題組又在HaploReg v4.1數(shù)據(jù)庫(http://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php)中查詢rs1007023位點在亞洲人群中的連鎖位點的調(diào)控功能數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有33個SNP位點與rs1007023的連鎖r2>0.8，其中有3個位點(rs1843809、rs10748187、rs6582081)為保守位點，其中rs1843809在RegulomeDB數(shù)據(jù)庫的評分是3a，并且位于HOXC-8轉(zhuǎn)錄因子的motif內(nèi)，具有很強的調(diào)控證據(jù)，有2個位點(rs10784942、rs4760749)是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，rs4760749位點同時與DHS、Enhance區(qū)域重疊，這2個位點在RegulomeDB數(shù)據(jù)庫的評分分別是4，4，可能結(jié)合GATA3、ERALPHA_A、P300等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控TPH2基因的轉(zhuǎn)錄表達，有5個SNP位點有調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif改變的提示數(shù)據(jù)，有14個位點包括rs1007023位點均有eQTL的證據(jù)，綜上所述rs1007023及其連鎖位點可能參與調(diào)控TPH2基因的表達，從而與ED的發(fā)生有所關(guān)聯(lián)，但rs1007023對勃起功能障礙的確切影響有待進一步研究，當(dāng)然本研究也存在一些局限性，如研究樣本量較小，其次中國ED患者超過50歲的男性由于尷尬甚至覺得年齡大ED是正?，F(xiàn)象，可能較少到本院門診就診，因此應(yīng)該考慮潛在的抽樣偏倚，需要進一步擴大樣本量的研究，如多中心招募更多的ED患者，以確認和擴展研究結(jié)果。

表2 SNPs位點信息表

表3 ED組與對照組單核苷酸多態(tài)性位點關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

表4 SNPs位點在ED組與對照組中不同遺傳模型下的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

綜上，本研究是首次研究TPH2多態(tài)性與ED的關(guān)系。結(jié)果表明rs1007023的等位基因及基因型頻率與ED有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。攜帶rs1007023 G等位基因或G/G+T/G等位基因的男性患ED的可能性較大，進一步的基因研究是必要的。