人卵巢漿液性腺癌原代細胞的改良體外培養(yǎng)方法

張晨晨，蔡澤宇，王 弦，江冬瑞，吳 強,3，王 晶

在女性常見腫瘤中卵巢癌的死亡率居高不下[1]，其中卵巢漿液性腫瘤死亡率占卵巢癌死亡率的70%[2]。因早期卵巢癌臨床癥狀不明顯，導致大多數(shù)患者無法得到較好的治療效果[3]。截至目前，國內(nèi)外對于卵巢癌的研究多數(shù)以商品化的細胞株為材料[4-5]，但相比之下原代培養(yǎng)的腫瘤細胞離體時間短，生物特性更接近體內(nèi)狀態(tài)，對卵巢癌防治的研究更有參考價值[6-7]。

目前國內(nèi)對于人卵巢漿液性腺癌原代細胞(human ovarian serous adenocarcinoma cells, HOSACs)的培養(yǎng)常用組織貼壁法[8]，但這種原代培養(yǎng)方法周期長、容易污染且成功率低，限制了其在卵巢癌領域的研究。該試驗通過改良酶的類型選擇和消化時間，成功建立一種快速高效的HOSACs培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集2018年1月～2019年5月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院卵巢腫瘤減滅術的新鮮人卵巢漿液性腺癌標本25例，所有病例均經(jīng)病理學診斷證實。所有患者在手術前未曾接受過化療或放療。依據(jù)最新的國家綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南，患者均為ⅡB～ⅢC期。上述組織標本的獲取已由患者家屬同意捐贈，并簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、胎牛血清(FBS)購于美國BI公司；透明質酸酶購于北京索萊寶科技有限公司；細胞無血清凍存液購于蘇州新賽美公司；青霉素-鏈霉素購于上海賽默飛世爾公司；表皮生長因子(epidermal grow factor，EGF)購于美國PeproTech公司；CCK-8試劑盒、細胞角蛋白CK7抗體、DAPI 購于上海碧云天科技公司。

1.2 方法

1.2.1試驗前準備 試驗前準備包括：① 組織沖洗液：PBS+青霉素-鏈霉素雙抗溶液；② 組織運轉液：DMEM培養(yǎng)基+青霉素-鏈霉素雙抗溶液；③ 改良版消化液：0.1 mg/ml透明質酸酶+0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA；④ 完全培養(yǎng)基的配制見表1。

表1 實驗完全培養(yǎng)基的配置

1.2.2組織塊基本處理 取手術切除的人卵巢漿液性腺癌組織，用無菌的生理鹽水沖洗,以去除組織上多余的血污；隨后將組織放入含有1%青-鏈霉素溶液的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基(即組織轉運液)中浸泡30～60 min；實驗開始時，用含有高濃度雙抗的PBS溶液(即組織沖洗液)漂洗2～3次，用眼科剪去除組織周圍毛細血管、脂肪組織以及壞死組織等；將修好后的組織置入25 ml高壓滅菌后的燒杯中，剪碎至1～3 mm3大小的組織塊分成兩等份，隨機標記為改良組與傳統(tǒng)組。

1.2.3改良組的細胞培養(yǎng) 將剪碎的組織轉移到離心管中，加入與組織塊等體積的改良版酶消化液，吹打混勻后置于37 ℃恒溫箱消化2～3 min；當組織出現(xiàn)稍粘稠狀態(tài)時應立即加入為消化液體積2～3倍的20% FBS的完全培養(yǎng)基終止消化；2 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入細胞體積2～3倍的完全培養(yǎng)基吹打混勻細胞及組織塊；吸取混勻后的組織細胞混懸液平鋪在培養(yǎng)瓶中，總體積以1～2 ml(25 cm的培養(yǎng)瓶)最合適，隨后放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天換去一半培養(yǎng)基，以后每天根據(jù)培養(yǎng)基顏色及細胞爬出的具體情況2～3 d換1次液。

1.2.4傳統(tǒng)組的細胞培養(yǎng) 將剪碎組織塊均勻的平鋪在培養(yǎng)瓶中，放置37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜置20～30 min后輕輕地翻轉瓶子，瓶底朝上；靜置過夜10～16 h后緩慢翻轉瓶子，并加入少許完全培養(yǎng)基，使組織浸入培養(yǎng)基中，置入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h；待第3天補充少許培養(yǎng)基；以后每2～3 d換1次液。

1.2.5培養(yǎng)細胞形態(tài)學觀察 通過相差顯微鏡來觀察48 h和72 h時間段HOSACs的形態(tài)學特征。

1.2.6免疫熒光鑒定HOSACs細胞純度 2種不同提取方法培養(yǎng)出的HOSACs在進行首次傳代時，分別接種至20 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，每皿2×105個細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛細胞固定，0.3%的Triton X-100破膜和山羊血清的封閉，以CK7一抗?jié)舛葹? ∶500、4 ℃孵育過夜，次日復溫后加抗兔的二抗以濃度1 ∶200、37 ℃避光孵育2 h；再經(jīng)DAPI室溫下染細胞核5 min；用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)，計數(shù)CK7陽性細胞率。

1.2.7CCK-8檢測細胞增殖能力并繪制細胞生長曲線 HOSACs培養(yǎng)到第2代時，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化細胞，置成單細胞懸液；改良組與傳統(tǒng)組各一組，以每孔3 000個細胞，接種到96孔板中，設置5個平行孔；隨后每隔24 h，取出待測的96孔板中5個孔，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在加入CCK-8后2 h讀450 nm處的吸光度(optical density, OD)值；連續(xù)觀察7 d，以時間為X軸，以A450為Y軸分別繪制改良組與傳統(tǒng)組的細胞生長曲線。

2 結果

2.1 2種原代培養(yǎng)方法的成功率原代細胞的培養(yǎng)過程中，在運輸、取材和操作3個時間段內(nèi)都是極易發(fā)生污染的；在25例標本中，改良組培養(yǎng)法有2例污染，無一例生長停滯。而傳統(tǒng)組培養(yǎng)法有3例污染，10例生長停滯，1例均為成纖維，11例培養(yǎng)出來的原代細胞含有較多的成纖維細胞并且在整個培養(yǎng)過程中癌細胞生長極其緩慢。

2.2HOSACs的形態(tài)學觀察

2.2.1相差顯微鏡觀察 改良組的原代細胞在培養(yǎng)48 h后，見細胞團貼壁延伸, 呈類圓形，細胞成團狀生長，符合卵巢癌細胞生長特性；而傳統(tǒng)組處理的原代細胞在48 h后，僅有組織塊的貼壁，極少量細胞從組織中爬出，見圖1，圖中箭頭所指的陰影部分為組織塊。在繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后改良組長滿瓶底，細胞呈短梭形，類鋪路石樣特征，其間夾雜較少量多角形細胞以及極少量成纖維細胞；而傳統(tǒng)組原代細胞在72 h后僅見少量短梭形細胞從組織塊中爬出，見圖2。

圖1 人卵巢漿液性腺癌不同提取方法后48 h細胞形態(tài) ×100

圖2 人卵巢漿液性腺癌不同處理方法后培養(yǎng)72 h的細胞形態(tài) ×100

圖3 HOSACs形態(tài)及CK7表達 免疫熒光細胞化學染色 ×400

2.2.2HOSACs細胞純度 培養(yǎng)的原代細胞經(jīng)CK7免疫熒光細胞化學染色后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CK7陽性細胞發(fā)出綠色熒光，同時記錄DAPI染核細胞總數(shù)，改良組的原代細胞算出CK7陽性細胞比率接近100%，說明細胞純度高；傳統(tǒng)組的原代細胞陽性率僅有50%(P<0.05)。見圖3。

2.3 CCK-8法測定HOSACs生長曲線2種處理方法所獲得的原代細胞增殖能力通過OD值可看出均符合腫瘤細胞的生長規(guī)律，見圖4A。在細胞接種第3與第7天后，可見改良組增殖速度明顯高于傳統(tǒng)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4B、C。

3 討論

近年來，隨著人們對腫瘤的深入研究，實體腫瘤的原代細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為腫瘤基礎研究方法的熱點，擁有離體時間短、與體內(nèi)細胞的生物學狀態(tài)相接近以及能極大限度的保存細胞內(nèi)的蛋白分子等優(yōu)點[8]。原代細胞常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有組織貼壁法和酶消化法，其中組織貼壁法最為常用。組織貼壁法在培養(yǎng)過程中不易游離出細胞，細胞生長易停滯且易污染。酶消化法常用的有胰酶和膠原酶，其中膠原蛋白酶消化能力弱、耗時長，從組織塊消化到絮狀物出現(xiàn)至少要數(shù)小時到數(shù)十個小時不等，在長時間的消化過程容易增加污染的概率，因此使用較少。胰蛋白酶-EDTA制劑的應用范圍最為廣泛，但是高濃度的胰酶由于消化能力過于強烈，若不能嚴格控制消化時間容則易對細胞造成損傷。

通過總結傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的優(yōu)點，本研究探索出一種簡單、高效提取HOSACs的方法。經(jīng)反復試驗研究，證實了改良組使用0.1 mg/ml透明質酸酶+0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA在37 ℃消化2～3 min的培養(yǎng)方法成功率最高。本試驗方法的優(yōu)點有:① 高純度：HOSACs最多的雜細胞為成纖維細胞，但成纖維細胞對于胰蛋白酶的敏感性要高于HOSACs，所以在首次消化時能去除絕大部分的成纖維細胞，從而提高HOSACs的純度；② 提取細胞速度快：對于間質較少的卵巢漿液性腺癌軟組織在強大消化能力的胰蛋白酶作用下可以快速消化成單細胞團；加上透明質酸酶水解透明質酸的能力，降低細胞間質的黏性，加速細胞分離[8]；因此在兩者的同時作用下可以快速分離出細胞[9]；③ 細胞生長快速：結合組織塊貼壁法，保留消化后的粘稠狀組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)是試驗成功獲取癌細胞的關鍵步驟之一。在胰酶刺激后從組織塊中爬出的細胞數(shù)量與速度都要遠高于傳統(tǒng)組織塊法；加上改良組消化液消化后得到的細胞懸浮液給組織塊提供了一個類似體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境，更加有利于細胞的生長。此外，研究[8]證明，表皮生長因子有助于細胞在對數(shù)生長期的增殖，因此在培養(yǎng)基中加入EGF(epidermal grow factor ,EGF)，在細胞培養(yǎng)過程中是有助于上皮性卵巢癌的生長。

圖4 HODACs生長曲線

A：細胞總生長曲線；B、C：第3天、第7天2組細胞OD值；與傳統(tǒng)組比較：**P<0.01

在反復試驗中總結發(fā)現(xiàn)，在人卵巢癌原代細胞培養(yǎng)中還需要注意幾點：① 取材：盡量在癌灶豐富的地方取且一定要注意無菌；② 消化時間：合理控制胰酶消化時間，不宜過長或過短；③ 消化酶的體積：必須嚴格根據(jù)剪碎后的組織塊體積來確定酶的量；④ 首次換液不宜過早，一般在24 h以后；換液頻率不宜過高，每2～3 d 一次較為適宜。⑤ 細胞混懸液與消化組織塊混合鋪板：由于細胞量大所以細胞之間更容易相互接觸，這樣在培養(yǎng)初期可以極大的減少細胞凋亡，很好的保持細胞的固有特性[6]。⑥ 增強細胞黏附和生長能力：高濃度胎牛血清培養(yǎng)。

綜上，由傳統(tǒng)組與改良組原代細胞培養(yǎng)的結果對比，得出改良組的提取方法可以在短時間內(nèi)獲得高純度、高增殖能力的HOSACs，從而為卵巢癌的深入研究奠定了良好的實驗基礎。