PRMT1影響胃癌PI3K-AKT通路基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析

劉蒙蒙，姜 浩，樓文暉，宋 超，孫劍勇，吳偉新

近年來胃癌發(fā)病率逐年升高，雖然通過手術(shù)及化療，患者生存期顯著延長，但總體死亡率仍居高不下[1]。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase, PRMT1)在體內(nèi)廣泛存在，發(fā)揮著重要作用，多年來的研究[2]表明PRMT1廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)以及mRNA剪接等多種細(xì)胞生理活動(dòng)過程。因此，對(duì)PRMT1的研究有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞生長與增殖調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望尋求腫瘤藥物治療的新靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組是連接生物功能與基因組遺傳信息的橋梁，在探索疾病的發(fā)生發(fā)展及基因調(diào)控等方面發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)通過高通量測(cè)序?qū)ξ赴┙M織標(biāo)本與癌旁組織的差異表達(dá)譜進(jìn)行京都基因與基因組百科全書富集分析(kyoto encyclopedia ofgenes and genomes, KEGG)，探討胃癌中PRMT1影響代謝通路的基因表達(dá)情況，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)層面為胃癌診治尋找新線索。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及主要試劑

1.1.1病例資料 選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院2018年9月胃癌患者術(shù)后新鮮胃癌組織標(biāo)本2例及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本2例，正常對(duì)照來自手術(shù)邊界5 cm以上，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。其中男1例，60歲；女1例，72歲。其病理均為胃中-低分化腺癌?；颊咝g(shù)前無放化療及靶向等腫瘤相關(guān)治療，無高血壓、糖尿病等合并癥。并選取2018年1～9月間在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科行胃癌根治手術(shù)患者的組織蠟塊。共入組25例，其中男15例，女10例，年齡64～82(64±9.385)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)診斷明確為胃腺癌；②術(shù)前無腫瘤相關(guān)治療。所有患者簽署知情同意書。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器 胃癌組織標(biāo)本總RNA提取試劑TRIzol?Reagen、定量試劑TBS380 Picogreen、mRNA分離儀器磁力架、Superscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；建庫試劑TruseqTM RNA sample prep Kit、橋式擴(kuò)增試劑簇生成試劑盒cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS購自美國Illumina公司；RNA質(zhì)控儀器安捷倫2100生物分析儀購自美國Agilent 公司；NanoPhotometre分光光度計(jì)購自德國Implen公司；Oligo d (T)25磁珠購自美國NEB公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Nanodrop公司；RNA保存于-80℃超低溫冰箱DW86L262，購自青島海爾集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)檢 ① 從胃癌組織標(biāo)本中提取總RNA，按照TRIzol試劑說明書操作，隨后質(zhì)控；檢測(cè)所提RNA完整性及濃度和純度，并利用Agilent 2100測(cè)定RIN值；② 利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，在NEB Next碎片緩沖區(qū)隨機(jī)打斷mRNA；③ mRNA片段為模板合成cDNA第一條鏈，降解RNA鏈，隨后以dNTPs為原料合成cDNA第2條鏈；④ 篩選150～200 bp的cDNA片段，PCR擴(kuò)增并純化；⑤ 最后對(duì)文庫進(jìn)行初步定量，并檢測(cè)插入片段大小，準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度(大于2×109mol/L)。

1.2.2上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 橋式PCR擴(kuò)增利用cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS簇生成試劑盒v3-cBot-HS生成clusters，利用Hiseq Xten平臺(tái)行雙端150 bp測(cè)序。為避免影響后續(xù)組裝的質(zhì)量及生物信息分析的準(zhǔn)確性，檢查鳥嘌呤和胞嘧啶含量分布及原始測(cè)序數(shù)據(jù)測(cè)序錯(cuò)誤率并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得后續(xù)待分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用STAR(v2.5.lb)軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析，RSEM(vl.2.28)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本水平的定量分析。采用edge R(v3.12.1)軟件進(jìn)行表達(dá)差異顯著性分析，clusterProfiler(v3.0.5)軟件對(duì)差異基因集行KEGG通路富集分析。

1.2.3免疫組化 25例胃癌組織標(biāo)本常規(guī)甲醛固定及石蠟包埋，將蠟塊切成5 μm厚的組織切片，覆蓋于預(yù)先經(jīng)過防脫處理的載玻片上，經(jīng)過烤片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗PRMT1(1 ∶300)、AKT(1 ∶200)，二抗：HRP-conjugated IgG(1 ∶500)，DAB顯色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡拍照。每個(gè)標(biāo)本選5個(gè)40×的視野，評(píng)出染色深度：無或弱染色為1分，中陽染色為2分，強(qiáng)陽為3分；陽性面積：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將上述2項(xiàng)分值相乘取平均，得到1～12分的總分區(qū)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，如方差分析結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及RNA-seq數(shù)據(jù)處理TRIzol法提取的胃癌和癌旁組織總RNA的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均達(dá)標(biāo)，分離mRNA并成功合成cDNA文庫，質(zhì)檢合格并測(cè)序。4個(gè)樣本進(jìn)行過濾和比對(duì)分析的待分析數(shù)據(jù)均占相應(yīng)原始數(shù)據(jù)的90 %以上。然后對(duì)RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析、基因水平定量及標(biāo)準(zhǔn)化處理。2組的唯一比對(duì)率77.4%～88.9%、91.5%～97.3%的reads可以比對(duì)到人類參考基因組上。見表1。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)人參考基因組比對(duì)率

2.2 差異表達(dá)分析利用edge R軟件篩選差異基因，q<0.05作為基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。2組取交集共獲得758個(gè)長度大于200 bp的差異表達(dá)基因,與正常胃黏膜組織相比,胃癌中表達(dá)下調(diào)基因251個(gè),包括PRMT1；表達(dá)上調(diào)基507個(gè)。通過 heatmap 軟件包對(duì)2組差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析并得到熱圖，表明了胃癌樣本組織中和正常組織間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因的分布情況。見圖1。

圖1 胃癌樣本組織中和正常組織間有差異基因熱圖綠色：下調(diào)基因；紅色：上調(diào)基因

2.3 KEGG分析本次KEGG富集分析利用KOBAS，并通過Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算。采用BH(FDR)方法多重檢驗(yàn)控制假陽性率，校正的P<0.05，滿足此條件的定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG通路。見圖2。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)25條顯著富集代謝通路，由于腫瘤的異質(zhì)性，將富集通路中基因數(shù)最多的10條代謝通路進(jìn)行列表。見表2。

2.4 PRMT1對(duì)PI3K-AKT通路關(guān)鍵基因表達(dá)相關(guān)性分析在PI3K-AKT信號(hào)通路中共有19個(gè)基因顯著富集。見表2。利用cBioportal數(shù)據(jù)庫將PRMT1分別對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路中該19個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)性分析，分析顯示PRMT1與PI3K-AKT信號(hào)通路上的PPP2R3A[P=2.070×10-14(Spearman),P=1.590×10-14(Pearson)]和THBS4[P=3.257×10-4(Spearman)，P=2.882×10-3(Pearson)]基因負(fù)相關(guān)，說明PRMT1可能影響PI3K-AKT信號(hào)通路。見圖3。

表2 胃癌和正常組織差異表達(dá)基因的KEGG顯著富集通路(P<0. 05)

圖2 KEGG通路富集結(jié)果

1:Amoebiasis;2:Legionellosis;3:Cytokine-cytokine recept…;4:Salmonella infection;5:NOD-like receptor signaling path way;6:Phagosome;7:Malaria;8:Toll-like receptor signaling pathway;9:Tuberculosis;10:Rheumatoid arthritis;11:Leish maniasis;12:Staphylococcus aureus infection;13:Folate biosynthes;14:Osteoclast differentiation;15:NF-kappa B signaling pathway;16:Renin-angiotensin system;17:Transcriptional misr egulation…;18:Chagas disease (Americ…;19:Platelet actiovation;20:cGMP-PKG signaling pathway;21:PI3K-Akt signaling pathway;22:ECM-receptor interaction;23:Basal cell carcinoma;24:Chemliine signaling pathway;25:Pertussis

圖3 胃癌樣本中PRMT1基因與PPP2R3A、THBS4表達(dá)相關(guān)性分析

2.5 胃癌組織中PRMT1與AKT蛋白為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRMT1影響PI3K-AKT信號(hào)通路的活性，課題組選取臨床25例胃癌組織標(biāo)本，分別利用PRMT1抗體和P-AKT(473Ser)抗體進(jìn)行免疫組化染色并打分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在下調(diào)的PRMT1胃癌組織中AKT 473絲氨酸磷酸化蛋白水平上調(diào)(P<0.001)，說明PRMT1的表達(dá)與AKT的活性負(fù)相關(guān)，暗示了PRMT1可能抑制PI3K-AKT信號(hào)。見圖4。

圖4 免疫組化染色及相關(guān)性分析 ×10

3 討論

PRMT1在PRMT家族最主要成員中，活性最高，占總催化活性的一半以上。PRMTs催化將s-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine, SAM) 甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸胍基氮原子上，形成對(duì)稱或不對(duì)稱的甲基精氨酸[3]。PRMT1屬于Ⅰ型PRMTs，哺乳動(dòng)物中，PRMT1是主要的精氨酸不對(duì)稱二甲基化酶，占不對(duì)稱二甲基化酶的90%以上，可以識(shí)別多肽RGG/RG序列[4]。在結(jié)構(gòu)上，PRMT1的同源二聚體上含有1個(gè)中間腔和2個(gè)相對(duì)應(yīng)的活性位點(diǎn)。PRMT1是第1個(gè)被克隆的真核PRMT，并且已有證據(jù)[5]表明其與p300/CREB結(jié)合蛋白、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶以及PRMT4/CARM1可以一起充當(dāng)核受體，作為介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄激活的共激活劑。多年來的研究[6]表明PRMT1廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)以及mRNA剪接等多種細(xì)胞生理活動(dòng)過程。該研究顯示PRMT1基因在胃癌組織中下調(diào)，這與以前的研究結(jié)果相吻合[7]。

PI3K-AKT信號(hào)通路作為惡性腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)控因子，已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，許多Akt信號(hào)通路抑制劑被發(fā)現(xiàn)具有多種功能和特異性。然而，目前對(duì)于該信號(hào)通路的調(diào)控及其在腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不明確。課題組利用KEGG對(duì)鳥嘌呤和胞嘧啶差異表達(dá)基因行富集分析，分析表明顯著富集的PI3K/AKT代謝通路中15個(gè)基因顯著上調(diào)。為分析PRMT1是否對(duì)PI3K/AKT代謝通路活化起作用，進(jìn)一步利用cBioportal數(shù)據(jù)庫相關(guān)性分析，PRMT1與其中2個(gè)基因 (PPP2R3A、THBS4) 緊密相關(guān)。

蛋白磷酸酶2A調(diào)節(jié)亞基B(“protein phosphatase 2 regulatory subunit B” alpha，PPP2R3A)從屬B"/PR72家族，為PP2A的調(diào)節(jié)亞基，有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)PPP2R3A可受DNA 甲基化而失活，其C-端甲基化可促進(jìn)核心酶結(jié)合B亞基。PPP2R3A可作為PP2A的調(diào)節(jié)亞基可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，具有潛在的促細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用。有研究[9]指出PP2A抑制劑LB100可以通過作用Thr308和Ser473位點(diǎn)抑制AKT的磷酸化從而抑制腫瘤增值。然而有趣的是，在一些特定的腫瘤中，PP2A抑制劑也能促進(jìn)AKT的磷酸化[10]。但其在胃癌中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道，本研究從mRNA水平發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中PPP3R2A顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)提示，PPP3R2A可能是胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

THBS4基因是凝血酶敏感蛋白家族(thrombospondins，THBS)新成員，其結(jié)構(gòu)各有一個(gè)氨基端和一個(gè)羧基端。參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸、黏附、游走、增殖及血小板聚集。在腫瘤中的研究較少，有的學(xué)者[11]指出THBS4在結(jié)直腸癌中表達(dá)減低，可能與其基因甲基化相關(guān)。而THBS4在肝癌中普遍高表達(dá)，是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Liu et al[12]發(fā)現(xiàn)下調(diào)THBS4前列腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著下降。Chen et al[13]證實(shí)在胃癌組織中THBS4蛋白高表達(dá)，促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移。課題組從mRNA水平的研究結(jié)果與之一致，本研究顯示THBS4在胃癌PI3K/AKT代謝通路中富集明顯，但具體機(jī)制尚不明確，其具體的調(diào)控途徑還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRMT1影響PI3K-AKT信號(hào)通路的表達(dá)，選取臨床25例胃癌組織標(biāo)本，分別利用PRMT1抗體和P-AKT(473Ser)抗體進(jìn)行免疫組化并打分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在下調(diào)的PRMT1胃癌組織中AKT 473絲氨酸磷酸化蛋白水平上調(diào)(P<0.001)，說明了PRMT1蛋白影響了AKT蛋白的磷酸化，暗示了PRMT1可能抑制PI3K-AKT信號(hào)，這與KEGG分析結(jié)果吻合。