高尿酸血癥誘導NLRP3炎癥小體活化GSDMD對血管內皮細胞的影響

蔣云，沈成興，潘靜薇，王占成，宋艷秋

高尿酸血癥是排除糖尿病、高血壓、肥胖等危險因素之外的又一可引起心血管疾病及慢性腎臟疾病發(fā)生的獨立危險因素，患者血清炎癥指標呈高表達，機體損傷的嚴重程度與機體的炎癥反應直接相關[1]。近年來，在慢性腎臟疾病、痛風性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化等諸多疾病中均發(fā)現(xiàn)有亮氨酸富集的核苷酸結合寡聚結構域3蛋白（NLRP3）炎癥小體的存在，NLRP是模式識別受體的一類，NLRP3是其中一種研究相對清楚的受體，該受體與凋亡相關點樣蛋白及胱天蛋白酶-1前體結合后將發(fā)生寡聚生成NLRP3炎癥小體[2]。該炎癥小體在發(fā)生活化期間會加速caspase-1前體自我催化并生成活化caspase-1，活化的caspase-1又將剪切白細胞介素-1β等前體至成熟形式并向細胞外分泌，參加多種自身炎癥性疾病的發(fā)病[3]。細胞焦亡是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的一種新的炎癥性程序細胞死亡模式，多種外刺激信號會通過相關途徑激活caspase-1，誘發(fā)細胞發(fā)生細胞焦亡，這種細胞焦亡雖有別于細胞凋亡，但其同時具備凋亡與壞死的特征[4]。炎癥小體是經典細胞交往的模式，近幾年隨著生物學研究的進展，一種未被關注的蛋白質-gasdermin D（GSDMD）的出現(xiàn)為細胞焦亡機制的研究帶來新的收獲[5]。但該蛋白質對內皮細胞焦亡的具體誘導機制尚未明確，且相關研究也不多見。本研究主要觀察高尿酸血癥是否會誘導NLRP3炎癥小體活化GSDMD導致內皮細胞焦亡，旨在為未來內皮細胞焦亡具體機制深入研究提供參考。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC培養(yǎng)基、內皮細胞（ECM）培養(yǎng)基。主要試劑：均由德國Sigma公司提供，包括Percoll P1644、Uric acid U2625 25 g、LPS L2630 10 mg、Anti-NLRP3 antibody、Anti-caspase3 antibody、Anti-caspase4 antibody、Anti-GSDMD antibody，尿酸粉末購自湖北鑫潤德化工有限公司，批號：170612，cck-8試劑盒購自默沙克生物科技公司。主要緩沖液與其他試劑：ECM、PBS、D-Hank's、0.25%（或 0.125%）胰蛋白酶溶液、細胞凍存液、4%多聚甲醛、封閉用10%正常羊血清、RIPA裂解緩沖液、5*SD上樣緩沖液、BSA、40%，Acr/Bic（37.5:1）、0.5MTris-HCL（PH6.8）、IMTris.HCL（PH7.5）、1.5MTrisHCL（PH8.8）、10%SDS、10%AP、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10x麗春紅染色液、20%Tween-20（v/v）、封閉液（含5%脫脂奶粉的 TBST）。

1.2 實驗材料的培養(yǎng)來源于ATCC細胞庫的120份人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）。（1）HUVEC培養(yǎng)：將分離得到的HUVEC懸液的細胞密度調定為1×106/ml，取4 ml接種在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶內，放置在5%二氧化碳、95%空氣細胞培養(yǎng)箱內，37℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，將未貼壁細胞去除，后每隔24 h半量更換培養(yǎng)液1次，指導細胞生長至融合狀態(tài)。（2）HUVEC傳代培養(yǎng)：①將無菌的PBS、0.125%的胰蛋白酶溶液、ECM預熱至37℃。②將細胞生長至融合狀態(tài)的25 cm2擴細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸棄，加入PBS清洗，后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶。③顯微鏡觀察，細胞皺縮迅速吸棄胰蛋白酶，加入含有FBS的ECM完全培養(yǎng)基中止消化。④處理后置于5%CO2/95%空氣細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間為24 h。⑤培養(yǎng)結束后更換培養(yǎng)液，直至細胞生長成為融合狀態(tài)。

1.3 實驗材料處理方法（1）HUVEC凍存：①細胞凍存前24 h將培養(yǎng)液更換。②收集對數生長期HUVEC（無菌操作下），吸棄培養(yǎng)基使用PBS清洗，加入胰蛋白酶溶液消化。③顯微鏡觀察，細胞皺縮吸棄胰蛋白酶，加速ECM完全培養(yǎng)基中止消化；④制作細胞懸液并進行細胞計數；⑤離心棄上清加入細胞凍存液，重懸細胞，保證細胞密度達到指定范圍，并轉存。⑥使用白膠布封閉凍存并標記。（2）HUVEC復蘇：①取出凍存管，置入水浴箱，融化后取出擦拭消毒；②無菌操作轉移細胞懸液至離心管；離心后加入ECM洗滌；③離心后棄上清，加速重懸細胞轉移至培養(yǎng)瓶，在5%CO2/95%空氣細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h；④更換培養(yǎng)液，指導細胞生長至融合狀態(tài)；⑤HUVEC分離與培養(yǎng)至第4～7代，待融合90%，將上清液去除，使用PBS清洗，使用胰蛋白酶消化，用EGM-2終止消化，離心后去上清，細胞計數板計數，調制細胞懸液，分別將細胞懸液滴入6孔板，培養(yǎng)24 h吸出原培養(yǎng)液。

1.3 分組與處理方法

1.3.1 分組方法按隨機數表法將培養(yǎng)的成功的120份HUVEC細胞分為3組。

1.3.2 尿酸-HUVEC細胞培養(yǎng)基配制稱取尿酸粉末15 mg，置于無菌細胞培養(yǎng)瓶內，無菌操作，將培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶，避光震蕩混勻加入培養(yǎng)基50 ml，制成30 mg/dl尿酸培養(yǎng)基溶液；尿酸培養(yǎng)基制作完成后需避光保存，在保存期間定期使用倒置相差顯微鏡與偏振光顯微鏡觀察尿酸-培養(yǎng)基的情況，若有異常情況發(fā)生則需要重新校正尿酸的濃度。實驗前將尿酸培養(yǎng)液換算為μmol/L，分別制備500、1000、1500 μmol/l的尿酸溶液。

1.3.3 分組處理將分組后產生的3組細胞分別進行處理，每種濃度兩個孔，HUVEC+ECM+500 μmol/L濃度尿酸，HUVEC+ECM+1000 μmol/L濃度尿酸，HUVEC+ECM+1500 μmol/L濃度尿酸。

1.3.4 培養(yǎng)基與細胞處理收集培養(yǎng)基在2 ml EP離心管內，經13000 r/min轉速離心10 min，使用PBS液沖洗，將細胞刮下，使用2 ml EP管采集細胞，在4℃條件下經10000 r/min轉速離心3 min，棄上清液。采用Western blot與免疫熒光測定細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達；同時測定各組內皮細胞LDH釋放量。使用CCK-8試劑盒檢測各組各組尿酸濃度下內皮細胞的細胞活力，計算不同濃度內皮細胞活力下降率。

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理數據，以（±s）表示計量資料，三組間比較采用單因素方差分析檢驗，以百分比表示計數資料，用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高尿酸引起的血管內皮細胞活力下降分別使用不同濃度的尿酸（500、1000、1500 μmol/L）處理12 h、24 h，使用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的細胞活力后結果顯示，在處理12 h的實驗模型內，僅有1500 μmol/L濃度的尿酸能夠明顯降低HUVECS的細胞活力，細胞活力下降率為50.00%（20/40）；在處理24 h的實驗模型內，各濃度尿酸組HUVECS細胞的細胞活力均有下降，各組細胞活力下降率分別為25.00%（10/40）、65.00%（26/40）、80.00%（32/40），可見隨著尿酸濃度增加，HUVECS細胞的細胞活力隨之下降，各濃度間比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=26.335，P＜0.001）。

2.2 不同尿酸濃度制備內皮細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達比較隨著尿酸濃度的升高，內皮細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達隨之升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。各尿酸濃度下各蛋白表達對照見圖1。

表1 不同尿酸濃度制備內皮細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達比較（±s）

表1 不同尿酸濃度制備內皮細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達比較（±s）

注：與500 μmol/L比較，aP＜0.05；與1000μmol/L，bP＜0.05

尿酸濃度 n caspase-3相對表達GSDMD相對表達500 μmol/L 40 0.51±0.07 0.32±0.05 0.31±0.04 1.02±0.04 1000 μmol/L 40 0.62±0.08a 0.41±0.06a 0.40±0.05a 1.51±0.05a 1500 μmol/L 40 0.71±0.09ab 0.52±0.07ab 0.50±0.06ab 1.78±0.07ab F值 - 62.062 109.455 140.779 1979.111 P值 - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 caspase-4相對表達NLRP3相對表達

圖1 不同尿酸濃度下各蛋白相對表達情況

3 討論

尿酸是由內源性核酸分解后及食物內攝入嘌呤經核苷酶分解后形成的次黃嘌呤，在黃嘌呤產生的氧化酶作用下轉化為黃嘌呤后，進一步降解生成的[6]。當機體血清尿酸濃度超過0.07 g/L（男性）或0.06 g/L（女性）時，即可誘發(fā)高尿酸血癥。流行病學研究指出，血尿酸高水平表達與高血壓、糖尿病、代謝綜合征、腎臟損害等心血管疾病發(fā)生緊密相關[7]。

血管內膜表面有血管內皮覆蓋，血管內皮不僅僅只是對血管內膜產生保護之效，同時還是關鍵的內分泌與旁分泌器官，參加調節(jié)血管壁的透通性、維持血管舒縮功能平衡、調節(jié)凝血功能平衡與血管炎癥反應等過程，對維持正常的心血管功能有著重要意義[8-10]。隨著1973年“內皮功能障礙”假說的提出，后大量的研究認為，不管是血尿酸水平正常亦或是異常者，其血清水平與內皮細胞功能均呈負相關，即隨著血清尿酸水平的升高，機體內皮功能將發(fā)生障礙，且功能障礙程度逐漸加重[12,13]。對于2型糖尿病患者及慢性心力衰竭患者而言，別嘌呤可以幫助內皮細胞改善，且二者之間的關系為劑量-效應關系。近期的研究指出，高尿酸血癥具有氧化應激促內皮細胞凋亡及活化NLRP3炎癥小體的作用[14]。

細胞焦亡作為炎性程序性細胞死亡新模式，體外多種刺激信號會通過各種途徑對caspase-1、caspase-4、caspase-5等直接激活，從而導致細胞焦亡發(fā)生。細胞焦亡的形態(tài)學具有細胞死亡與凋亡的特點，但又與其有著明顯的差別。細胞焦亡與細胞凋亡相似的是，二者均會出現(xiàn)細胞核濃縮及染色質DNA斷裂等情況；而細胞焦亡與細胞凋亡的差異之處在于，細胞焦亡期間細胞膜將出現(xiàn)空隙，破壞細胞膜完整性，損傷細胞膜進出物質調控能力，溶解細胞膜，大量細胞內容物由空隙處釋放，進而誘發(fā)炎癥反應[15]。同時細胞焦亡發(fā)生期間還將釋放出大量白介素-18及白介素-1β，二者均是炎癥細胞介質，在募集更多的炎癥細胞因子后，會擴大炎癥反應。按照功能差異，可將Caspase分為炎性半胱氨酸蛋白酶與凋亡半胱氨酸蛋白酶，但需要注意的是，細胞焦亡不是一種經傳統(tǒng)凋亡分子所介導的過程，其主要炎性半胱氨酸蛋白酶所介導，在人體中炎性半胱氨酸蛋白酶常見Caspase-4與Caspase-5。研究證實，無論是小鼠亦或是人體，均有兩種途徑的細胞焦亡模式，即經典細胞焦亡與非經典細胞焦亡，無論是哪種焦亡模式均在激活后參加了諸多疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。

半胱氨酸蛋白酶-1前體與模式識別受體經接頭蛋白間接連接形成的高分子復合物即炎癥小體，在病原微生物的刺激下，炎癥小體能加工無活性半胱氨酸蛋白酶-1前體，并發(fā)生裂解，從而形成誘惑性的Caspase-1，來誘導細胞膜穿孔發(fā)生，致細胞的溶解并死亡，細胞膜的不完整性將利于胞內物質外流，從而引發(fā)炎癥[17]。上述機制是經典的細胞焦亡途徑。隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，在2015年Nature上刊登了并報道了一種未被關注的蛋白質Gasdermin-D（GSDMD），該實驗指出在未檢出GSDMD小鼠內皮細胞內，由NLRP3等炎癥小體介導的細胞焦亡未啟動成功，提示內皮細胞焦亡可能有GSDMD活化的參與[18]。既往研究指出，受LPS刺激，Caspase-4、Caspase-5將直接結合LPS并啟動細胞焦亡，使得細胞膜發(fā)生穿孔、溶解與死亡，從而誘發(fā)炎癥反應[19]。這種依賴于Caspase-4、Caspase-5并發(fā)生在人體內細胞死亡模式是非經典細胞焦亡模式，其機制已經得到證實[20]。

因LPS刺激炎癥反應導致的細胞焦亡已被證實是非經典的細胞焦亡模式，故本研究將其作為對照，來觀察高尿酸血癥誘導NLRP3炎癥小體活化GSDMD是否會導致內皮細胞焦亡的發(fā)生。本研究結果顯示，在受不同濃度尿酸刺激后，隨著尿酸濃度的升高，內皮細胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達隨之升高，該結果與受LPS刺激的細胞變化模式一致，可以推測高尿酸誘導的NLRP3炎癥小體活化GSDMD參與并推動了內皮細胞焦亡，GSDMD是細胞焦亡發(fā)生進展的關鍵物質。這可能與活化的Gaspase-5、Caspase-5能夠裂解GSDMD蛋白有關，GSDMD蛋白裂解后N端將介導細胞溶解與焦亡；此外，還可激活NLRP3炎癥小體活化Caspase，生成IL-18、IL-1β等炎癥介質，機體發(fā)生炎癥反應后，活化的Caspase-5與Caspase-5將激活通道Pannexin-1，釋放出大量的ATP從而導致細胞膜相關通道開放，使細胞膜形成小孔從而誘導細胞焦亡。但目前國內尚缺乏CSDMD介導內皮細胞焦亡的相關研究，故本研究所得結果并未得到較多的循證學依據證實，結果的真實性與可靠性還應在未來展開大量的實驗研究加以驗證。

綜上所述，高尿酸血癥可引起內皮細胞NLRP3炎癥小體激活，誘發(fā)細胞炎癥反應，通過介導細胞中GSDMD活性，從而引起內皮細胞焦亡的發(fā)生。