阿托伐他汀對大鼠心肌梗死后心肌纖維化的干預(yù)作用

陳仕毅，陳曉茹，劉羽，劉少奎

導(dǎo)致心肌梗死后心肌重構(gòu)以及心臟功能障礙因素眾多，心肌纖維化是關(guān)鍵因素之一，與死亡密切相關(guān)，其是一個漸進的過程，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、抑制心肌纖維化可能是改善心肌梗死預(yù)后的重要靶點，但心肌梗死后心肌纖維化的機制尚不完全明確。有研究表明periostin蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）mRNA在多種病因所致心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用[1,2]。心肌梗死后心肌纖維化是否與其及信號通路相關(guān)，目前研究較少。本研究通過建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察阿托伐他汀藥物治療對心肌梗死大鼠心肌組織periostin蛋白及TGF-β1mRNA的表達水平，探討阿托伐他汀藥物在急性心肌梗塞（AMI）后逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)、抑制心肌纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型建立6～8周齡雄性SD大鼠60只，體重160～180 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。在室溫20 ℃～25 ℃的動物房中飼養(yǎng)3 d后，雄性SD大鼠隨機分3組：正常組（Sham）20只、單純心肌梗死組（MI）20只、心肌梗死聯(lián)合阿托伐他汀組（Ato）20只。

建立AMI模型：參照文獻制備大鼠心肌梗死模型[3,4]：MI組和Ato組大鼠分別予以異丙腎上腺素85 mg/（kg·24 h）皮下注射，連續(xù)2 d。行心電圖檢查見ST段抬高，病理性Q波形成，提示造模成功。Sham組予以等量的生理鹽水皮下注射，查心電圖提示無變化。第2次異丙腎上腺素皮下注射完成4 h后予以Ato組大鼠阿托伐他汀鈣5 mg/（kg·d）灌胃，Sham組和MI組等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。第3 d MI組及Ato組大鼠繼續(xù)予以異丙腎上腺素注射液2 mg/（kg·d）皮下注射制大鼠心肌纖維化[5,6]模型，Sham組予以等量的生理鹽水皮下注射，連續(xù)14 d。

8周處死大鼠，稱量3組大鼠體重（BW），開胸取心臟，置于生理鹽水中清洗，剝離并剪去心臟周圍組織及大血管，濾紙吸干后，稱取心臟質(zhì)量（HW），計算HWI（HWI=HW/BW），做為判斷心肌肥厚的標(biāo)志。沿室間隔將心臟一分為二，取部分心間組織于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，留做HE染色，觀察心肌病理改變及心肌纖維情況；Masson染色觀察并計算心肌纖維化中膠原纖維的容積分?jǐn)?shù)（CVF）；另一部于液氮中保存，留做RT-PCR用，檢測periostin蛋白和TGF-β1 mRNA的表達情況。

1.2 主要試劑與儀器阿托伐他?。?Pfizer Co.,Ltd）。PCR擴增試劑盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、DNA Marker（Shanghai shenggong Co., Ltd）、UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、引物合成（Shanghai shenggong Co.,Ltd）。高速微型離心機（DGW99）型（深圳市點晶科學(xué)儀器有限公司）、紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司）、DY-300型低壓電泳儀（汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司）、電熱恒溫水浴箱（海躍進醫(yī)療器械廠）、低壓電泳儀（DYY-8C）（北京市六一儀器廠）、基因擴增儀（TCXP-E）（杭州博日科技有限公司）、凝膠掃描成像系統(tǒng)（Gel 2020D） （Binta 公司分析軟件）恒溫石蠟箱、石蠟切片機、電子顯微鏡（大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科提供）。

1.3 RT-PCR檢測各組心肌組織中periostin蛋白及TGF-β1的表達8周分別取MI組及Sham組及Ato組大鼠的心肌組織，依據(jù)RT-PCR試劑說明書，按步驟分別檢測periostin蛋白及TGF-β1的表達量。①提取RNA：稱取不少于30 mg的心肌組織，將研磨后的心肌組織置于離心管中并加入RLT Solution后震蕩混勻，離心并吸取上清液加入無水乙醇后混勻，使用吸附柱及DEPC-treated ddH2O獲得RNA溶液。②RNA純度的測定：使用DEPC處理水將提取的RNA稀釋，使用紫外分光光度計測定A260值及A280值。用DEPC-Treated ddH2O作為空白對照。③RNA反轉(zhuǎn)錄：將提取的RNA加入Oligo（dT）及RNase-free ddH20后混勻并離心，65℃溫浴5 min，冰浴30 s，離心。再加入Reaction Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mix、M-MuLV RT，混勻后離心。在PCR儀上進行cDNA合成（45 ℃），終止反應(yīng)（72 ℃）。④RT-PCR：cDNA產(chǎn)物加入上游Primer、下游Primer、Taq DNA Polymerase等試劑，通過變性、退火、延伸等步驟進行擴增，periostin蛋白、TGF-β1、β-actin退火溫度分別為54 ℃、60℃、54 ℃。⑤PCR產(chǎn)物檢測：PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠溶液進行電泳，在紫外觀測儀上觀察電泳結(jié)果，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶。光密度灰度掃描后圖片經(jīng) Image J軟件分析，結(jié)果以檢測基因/β-actin的積分光密度比值表示。計算出 TGF-β1、periostin mRNA 的相對表達量。⑥引物設(shè)計：TGF-β1、periostin蛋白和β-肌動蛋白（β-actin）基因序列通過 GenBank獲得，由上海生物工程有限公司合成提供（表1）。

表1 引物系列及反應(yīng)條件

1.4 病理切片取左心室冠狀面中部切片，置于4%的多聚甲醛溶液中固定10 h石蠟包埋待用。按5 μm厚切片隨機取3張切片進行觀察，切片HE染色（蘇木精和Masson染色法）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件數(shù)據(jù)處理，平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型結(jié)果造模過程中MI組大鼠死亡2只，Ato組死亡1只，考慮為心肌梗死后心力衰竭致死。結(jié)果為Sham組大鼠20只，MI組18只，Ato組19只。

2.2 心電圖變化和各組間HWI比較異丙腎上腺素皮下注射第2 d心電圖檢查見MI組和Ato組大鼠Ⅱ?qū)T段明顯向上抬高。及病程進展心電圖動態(tài)演變過程；心電圖設(shè)置走紙速度為50 mm/s（圖1）。開胸取心臟后見MI組大鼠心臟較Sham組明顯增大，心臟重量/體重（HWI）明顯增大，差別具有顯著意義（P＜0.01）；與AG組相比，Ato組HWI明顯減低（P＜0.05）；與Sham組相比，Ato組HWI略增大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組HWI值（表2）。

圖1 A：造模前 B：造模第二天 C：造模兩周后

表2 各組心臟重量指數(shù)（HWI）比較（±s）

表2 各組心臟重量指數(shù)（HWI）比較（±s）

組別 Sham組 Ato組 心肌梗死組HWI（mg/g） 3.221±0.357 3.452±0.312ac 4.088±0.513ab

2.3 HE染色大鼠心肌細(xì)胞的病理改變Sham組心肌細(xì)胞未見明顯病理改變；MI組可見細(xì)胞核排列紊亂，部分細(xì)胞核消失，胞質(zhì)呈粗顆粒狀，心肌纖維橫紋斷裂明顯，排列紊亂，可見大量炎性細(xì)胞；而Ato組可見心肌細(xì)胞排列相對整齊，纖維斷裂明顯減少，纖維化有所減輕，心肌細(xì)胞炎性壞死明顯減少（圖2）。

2.4 Masson染色觀察心肌纖維化情況Sham組未見膠原纖維形成；MI組可見大量成簇及散在的膠原纖維形成、堆積；Ato組可見少量散在的膠原纖維形成；MI組及Ato組CVF均明顯高于Sham組（P＜0.01）；而Ato組CVF明顯低于MI組 （P＜0.05），（圖3、表3）。

2.5 RT-PCR結(jié)果分析與Sham組相比，MI組和Ato組的TGF-β1及periostin蛋白表達量均顯著增加（P＜0.01）；與MI組相比，Ato組TGF-β1及periostin蛋白的表達量顯著下降（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

目前心肌梗死已然成為嚴(yán)重危害人類身心健康的公共衛(wèi)生問題，不但致死率高，還大大降低了患者的生活質(zhì)量。雖然急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）技術(shù)愈加成熟，大大降低了急性心肌梗死的死亡率。但是心肌梗死后壞死心肌的炎癥反應(yīng)、存活的心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化，心室收縮及舒張功能障礙，心臟順應(yīng)性進行性下降仍然不可避免，最終大部分患者還是因急、慢性心力衰竭導(dǎo)致死亡。他汀類藥物調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊作用于心肌梗死預(yù)后的療效已經(jīng)明確，但其抑制心肌梗死后心肌纖維化的可能機制尚存在多種爭議。

圖2 各組心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果 （×400）（A：Sham組 B：Ato組 C：MI組）

圖3 各組心肌組織Masson染色結(jié)果（×400）（A：Sham組 B：Ato組 C：MI組）

表3 各組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）結(jié)果（±s）

表3 各組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）結(jié)果（±s）

注：CVF：心肌膠原容積分?jǐn)?shù)；與Sham組比較， aP＜0.001；與MI組比較，bP＜0.05

組別 Sham組 Ato組 MI組CVF 8.102±2.722 36.719±10.691ab 48.001±3.234a

圖3 各組心肌組織TGF-β1及periostin mRNA表達（1 Sham組；2 MI組；3 Ato組）；與Sham組相比，aP＜0.01；與MI組相比，bP＜0.05

本研究應(yīng)用異丙腎上腺素注射所致大鼠心肌梗死后心肌纖維化模型，結(jié)果顯示，心肌梗死組大鼠HWI較正常組明顯升高，心肌組織病理染色及Masson染色均提示有明顯纖維化發(fā)生，膠原纖維沉積明顯增多，說明發(fā)生了心肌梗死后心肌纖維化及心室重構(gòu)。在心肌梗死初期的炎癥階段，TGF-β1在心肌梗死區(qū)大量被激活以促進壞死心肌細(xì)胞完成瘢痕修復(fù)過程，起到防止心臟發(fā)生破裂的作用；但是隨著心肌重構(gòu)的病程進展，TGF-β1不僅在梗死區(qū)心肌細(xì)胞大量表達，在非梗死區(qū)心肌細(xì)胞中也可通過自分泌或旁分泌持續(xù)表達，出現(xiàn)惡性循環(huán)，導(dǎo)致非梗死區(qū)心肌的損傷、纖維化形成[7]。本實驗提示在心肌梗死（MI組）TGF-β1的表達較Sham組是明顯增高的，與Sovari等[7]研究結(jié)果一致；而他汀藥物干預(yù)（Ato組）較MI組是降低的，P＜0.05。阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑，除了調(diào)脂以外，還有抗炎、降低TGF-β1的作用[8]。田艷等研究也發(fā)現(xiàn)了阿托伐他汀可降低大鼠擴張心肌病心肌細(xì)胞TGF-β1的表達，改善心肌纖維化[9]。本實驗提示阿托伐他汀可降低心肌梗死后TGF-β1的表達。但是，Paige等發(fā)現(xiàn)僅TGF-β本身增加并不出現(xiàn)心肌的纖維化，只有導(dǎo)致periostin蛋白水平上調(diào)后才會出現(xiàn)心肌纖維化的表現(xiàn)[10]。而periostin蛋白的過度表達將加重心肌纖維化，惡化左室重構(gòu)，成為心肌梗死后心力衰竭的病理基礎(chǔ)。periostin，又名骨膜素，是一種近年發(fā)現(xiàn)的分泌型可溶解性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的一種，是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族的新成員，是由成纖維細(xì)胞分泌的，參與細(xì)胞粘附。TGF-β1是ECM平衡的主要調(diào)節(jié)劑，通過誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞中各種ECM蛋白的表達，促進纖維化形成發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Shimazaki等[12]檢測純化后的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞顯示：periostin蛋白絕大部分在心肌成纖維細(xì)胞中表達，并由其直接分泌，在纖維化條件下表達明顯。通過本研究，我們觀察到經(jīng)過阿托伐他汀處理過的大鼠（Ato組）較MI組大鼠TGF-β1、periostin蛋白的表達均是明顯降低的；同時通過心肌Masson染色，我們觀察到經(jīng)過阿托伐他汀處理過的大鼠（Ato組）較MI組大鼠心肌纖維化程度是明顯降低的；并且我們也觀察到經(jīng)過阿托伐他汀處理過的大鼠（Ato組）較MI組心臟重量指數(shù)（HWI）也是明顯改善的。進一步證實了阿托伐他汀降低心肌纖維化的同時也抑制了MI組大鼠TGF-β1、periostin蛋白的表達。因此，我們推測阿托伐他汀能夠改善心肌重構(gòu)、降低心肌纖維化的作用與其對TGF-β1/periostin信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)相關(guān)。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明：阿托伐他汀可減輕心肌梗死后大鼠心肌纖維化、改善心肌重構(gòu)，該作用機制可能與其抑制TGF-β1/periostin信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。但對其這一作用的具體藥理機制仍需進一步研究。