脂聯(lián)素通過Nrf2/HO-1通路對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究

李媛莉，趙繼波，張三明

急性心肌梗死（AMI）后的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是心功能損傷的主要機(jī)制，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制急性心肌缺血后的細(xì)胞凋亡是治療AMI的主要策略[1]。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路，在AMI繼發(fā)損傷中發(fā)揮重要作用[2]，研究顯示激活Nrf2/HO-1通路可緩解缺血再灌注后心肌損傷[3]。脂聯(lián)素（APN）是一種由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)新陳代謝、保護(hù)血管和心臟的作用。最新研究顯示在心肌缺血再灌注損傷大鼠模型中，APN的水平顯著降低，且APN水平與心肌梗死面積呈負(fù)相關(guān)[4]，提示其具有保護(hù)AMI心肌損傷的作用。本文分析APN對(duì)AMI大鼠心功能的影響，并探究其對(duì)Nrf2/HO-1影響的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和材料選取45只SPF級(jí)雄性SD大鼠220～250 g（南京金陵醫(yī)院，中國），APN（Sigma公司，美國），Mayer's蘇木精和0.5%曙紅水溶液（H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中國），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒（碧云天公司，中國），酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國），RIPA裂解緩沖液（中國，北京，Beyotime），BCA蛋白測(cè)定試劑盒（北京Applygen公司，中國），抗體購自美國Abcam公司，PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）。小動(dòng)物超聲成像儀（麟得科學(xué)儀器有限公司，中國），BX-42光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation，日本）。

1.2 動(dòng)物分組、建模和干預(yù)45只大鼠隨機(jī)分為3組：Sham組、AMI組和AMI+APN組，每組各15只。AMI組和AMI+APN組大鼠通過結(jié)扎方法建立AMI模型[5]，首先腹腔注射1%戊巴比妥（劑量為3 ml/kg）麻醉大鼠，麻醉后連接心電圖，剪開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約2 mm處的冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎。結(jié)扎后心電圖顯示大鼠心電圖顯示QRS波增寬，則為結(jié)扎成功，保持結(jié)扎30 min后，取出絲線進(jìn)行再灌注，縫合胸腔。術(shù)后注射8萬單位的青霉素抗感染干預(yù)，持續(xù)3 d。Sham組打開胸腔暴露心臟但不結(jié)扎，縫合胸腔后注射青霉素，方法與AMI組相同。AMI+APN組大鼠在建模第2 d使用APN腹腔注射，劑量為10 μg/kg，Sham組和AMI組給予等量生理鹽水干預(yù)1/d，連續(xù)7 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 心功能指標(biāo)通過超聲成像儀行心臟功能檢查，檢測(cè)指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室內(nèi)壓力最大/小變化率（±dp/dt max）。

1.3.2 心肌酶指標(biāo)大鼠麻醉后處死，收集血液樣本，在2000 rpm離心20 min后，取上層血清。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)肌酸激酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH），根據(jù)說明書加入抗體，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.3.3 HE染色大鼠處死后取出心臟，并將心臟組織在室溫下用4%多聚甲醛中固定過夜，室溫下通過梯度濃度的乙醇處理（80%持續(xù)2 h，90%持續(xù)2 h，95%過夜，100%分別持續(xù)0.5 h、0.5 h和1.0 h），然后包埋在石蠟中。將石蠟樣品切成4 μm厚的切片，Mayer's蘇木室溫下精染色10 min，0.5%曙紅水溶液室溫下染色3 min。細(xì)胞核和其他酸性結(jié)構(gòu)被染成藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。使用光學(xué)顯微鏡以×400放大率采集圖像。

1.3.4 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡心肌組織按照1.3.3的方法將組織固定并切成10 μm的厚度切片，使用DAPI染色細(xì)胞核，加入TUNEL試劑染色凋亡細(xì)胞。在顯微鏡×400放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇五個(gè)視野，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞計(jì)為凋亡細(xì)胞，凋亡率=（綠色熒光細(xì)胞數(shù)目/視野中細(xì)胞核總數(shù)目）×100%。

1.3.5 Western blot在液氮下將心肌組織研磨并使用RIPA裂解緩沖液裂解，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量總蛋白含量。SDS-PAGE分離等量的總蛋白（120 V下電泳90 min），將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（50 V，120 min），在含5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。將PDVF膜與anti-Nrf2、anti-OH-1（1:500稀釋）4°C孵育過夜，加入1:5000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。應(yīng)用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔作為平行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件。3組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 APN對(duì)AMI大鼠心功能的影響AMI組大鼠LVEF（44.24±6.58%）、±dp/dt max（3.84±1.16×103mmHg/s，2.81±0.90×103mmHg/s）水平顯著低于Sham組（P＜0.05），AMI+APN組LVEF（61.46±6.54%）、±dp/dt max（4.89±1.45×103mmHg/s，3.52±1.33×103mmHg/s）水平顯著高于AMI組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠LVEF和±dp/dt max比較

2.2 APN對(duì)AMI大鼠心肌酶指標(biāo)的影響AMI組CK-MB（109.68±9.65 kU/L）和LDH（134.26±11.92 kU/L）顯著高于Sham組（P＜0.05），AMI+APN組CK-MB（71.69±8.74 kU/L）和LDH（97.56±12.44 kU/L）顯著低于AMI組（P＜0.05）（表2）。

2.3 心肌HE染色結(jié)果Sham組心肌細(xì)胞形態(tài)呈梭形，且細(xì)胞與細(xì)胞之間排解緊密。AMI組心肌細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞間出現(xiàn)大量空隙并排列紊亂。AMI+APN組心肌細(xì)胞排列基本正常，空隙顯著減少（圖1）。

表2 各組CK-MB和LDH水平比較

圖1 HE染色檢測(cè)心肌組織損傷情況（×400）

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。AMI組的凋亡率（44.21±3.98%）顯著高于Sham組（3.18±0.08）（P＜0.05），AMI+APN組心肌細(xì)胞凋亡率（23.58±3.78%）顯著低于AMI組（P＜0.05）（圖2）。

2.5 各組Nrf2/HO-1通路水平比較與Sham組比較，AMI組Nrf2和HO-1水平顯著降低（P＜0.05），AMI+APN組Nrf2和HO-1水平顯著高于AMI組（P＜0.05），（表3、圖3）。

圖2 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況（×400）

表3 各組Nrf2和HO-1蛋白水平比較

3 討論

AMI是世界范圍內(nèi)引起人類死亡的主要原因之一，心肌組織的血液灌注受阻會(huì)引起氧自由基等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生增加，促進(jìn)有害細(xì)胞信號(hào)的激活，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)并引起心肌損傷，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)是治療AMI的重要途徑[6]。

圖3 Western blot檢測(cè)Nrf2/HO-1通路中蛋白水平

APN是一種由脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，有調(diào)節(jié)線粒體的作用，APN降低會(huì)引起線粒體損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，APN與ST段抬高型AMI患者病情有關(guān)，病變?cè)街氐幕颊逜PN水平越低[7]。徐小靜等[8]研究也顯示了APN與缺血引起的組織損傷有關(guān)。有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示APN干預(yù)可緩解2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激水平[9]。據(jù)此我們推測(cè)APN可能會(huì)緩解AMI引起的心肌損傷。本文通過結(jié)扎方法建立AMI大鼠模型，并通過心電圖證實(shí)建模成功，用腹腔注射APN干預(yù)。結(jié)果顯示應(yīng)用APN干預(yù)后，大鼠心肌損傷情況顯著緩解，并降低了心肌酶指標(biāo)，具有改善心功能的作用。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)APN干預(yù)可有效緩解AMI引起的心肌損傷并保護(hù)心功能。

為進(jìn)一步探究APN緩解AMI心肌損傷的機(jī)制，我們對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。梗死區(qū)域以及后續(xù)心肌細(xì)胞的損傷和凋亡是引起AMI患者心肌損傷和心功能受損的重要病理基礎(chǔ)，這會(huì)導(dǎo)致左心室重塑、纖維化甚至心力衰竭，抑制梗死后心肌細(xì)胞凋亡是保護(hù)心肌功能的重要途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)顯示，AMI組凋亡率（44.21±3.98%）顯著高于Sham組（3.18±0.08），AMI+APN組心肌細(xì)胞凋亡率（23.58±3.78%）顯著低于AMI組，說明APN可顯著緩解AMI引起的心肌細(xì)胞凋亡。Nrf2/HO-1通路是抗氧化的重要途徑，研究顯示Nrf2和HO-1水平上調(diào)可緩解缺血引起的氧化應(yīng)激損傷[11]，且Nrf2/HO-1通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激或炎性反應(yīng)的方式，直接調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡[12,13]。本研究還顯示AMI組Nrf2和HO-1水平顯著低于Sham組，AMI+APN組Nrf2和HO-1水平顯著高于AMI組。有研究顯示APN可通過激活Nrf2相關(guān)通路改善高血糖引起的心臟肥大和功能障礙[14]。Enji等[15]研究顯示APN具有激活Nrf2通路的作用。這提示在AMI大鼠模型中，APN可能通過激活Nrf2/HO-1通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，APN可能通過促進(jìn)Nrf2/HO-1通路抑制AMI模型大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)心功能的作用。但關(guān)于APN對(duì)AMI的影響及調(diào)控Nrf2/HO-1通路的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。