結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

繳 莉，劉如明，龍加福，周 穎

（南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

0 引 言

顯微鏡教學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)教學(xué)課程中的重要組成部分，是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力、科研思維的重要教學(xué)環(huán)節(jié)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的大型儀器出現(xiàn)并應(yīng)用于科學(xué)研究中，如激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超高分辨顯微鏡等。這些大型儀器具有構(gòu)造精密、操作復(fù)雜、運(yùn)行維護(hù)成本高等特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中通常只進(jìn)行演示實(shí)驗(yàn)，很少開(kāi)放讓學(xué)生獨(dú)立操作［1-2］。對(duì)此，我校生命科學(xué)學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)顯微成像儀器室在大型儀器實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式上進(jìn)行了積極的思考與探索。本文將以大型精密儀器結(jié)構(gòu)光照明顯微成像系統(tǒng)Delta Vision OMX SR為例，介紹OMX SR的工作原理和應(yīng)用進(jìn)展，詳細(xì)描述該顯微鏡的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程設(shè)計(jì)內(nèi)容。

1 結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡及其在生物學(xué)中的應(yīng)用

1.1 結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡

結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）是超高分辨顯微鏡的一種類(lèi)型，結(jié)構(gòu)光就是改變了空間結(jié)構(gòu)的特殊調(diào)制光源。早在1999 年，Heintzmann 等［3］首次發(fā)表了用調(diào)制光照明樣品并獲得超分辨圖像的文章。在此基礎(chǔ)上，Gustafsson［4-5］實(shí)現(xiàn)了經(jīng)典的二維結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)2D-SIM。到2008 年，SIM 被成功應(yīng)用到三維空間，實(shí)現(xiàn)了3D-SIM。至此，線性熒光激發(fā)的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)將成像的空間分辨率提高了兩倍［6-7］。在2012年，Rego等［8］又用非線性結(jié)構(gòu)光激發(fā)樣品并成像。與線性結(jié)構(gòu)光照明顯微成像相比，非線性結(jié)構(gòu)光照明顯微成像的分辨率進(jìn)一步提高［9］。

光的衍射極限限制了光學(xué)顯微鏡成像分辨率的提高。根據(jù)光學(xué)傳遞函數(shù)，顯微系統(tǒng)只能接收樣品中低頻信息，代表細(xì)節(jié)的高頻信息將被濾除。結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的成像原理是利用改變了空間結(jié)構(gòu)的特殊調(diào)制光源照明樣品。根據(jù)莫爾條紋的原理，當(dāng)調(diào)制光場(chǎng)的高空間頻率信息和樣品的高空間頻率信息相疊加時(shí)，這兩種高頻信息將被編碼成可以被探測(cè)、解析的低頻信息。已知調(diào)制光也就是其中一個(gè)高頻信息的參數(shù)包括入射角度、相位和光強(qiáng)分布，也已知疊加后的低頻信息。通過(guò)特定的計(jì)算機(jī)算法，樣品中代表細(xì)節(jié)的高頻信息就從探測(cè)到的低頻信息中解析出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了顯微成像分辨率的提升［10］。

1.2 結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡出現(xiàn)后被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)、蛋白精確定位和活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)等研究中。利用結(jié)構(gòu)光照明成像技術(shù)，科學(xué)家們?cè)趤喖?xì)胞水平的研究有了新的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展。

在研究細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)方面，2015 年，M?nkem?ller等［11］聯(lián)合使用3D-SIM 和dSTORMDE 清晰地解析了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。2017 年，Hong 等［12］用突觸前標(biāo)記物突觸小泡蛋白和突觸后標(biāo)記物PSD-95 標(biāo)記了神經(jīng)元，通過(guò)3D-SIM成像，成功解析了神經(jīng)元突觸的精細(xì)結(jié)構(gòu)。2017 年，Yadav 等［13］用3D-SIM 成功觀測(cè)到了血小板中的顆粒成分α-Granules。α-Granules 是血小板內(nèi)部存在的顆粒成分，其平均直徑190 nm，長(zhǎng)340 nm，彼此間距為20 ～50 nm。2018 年，Sawada等［14］用3D-SIM結(jié)合新的樣品處理方式，成功獲得了小鼠腦切片中樹(shù)突精細(xì)結(jié)構(gòu)的圖像。

在研究蛋白定位方面，Roth等［15］研究了有絲分裂過(guò)程中凋亡抑制蛋白Survivin 的定位機(jī)制，利用3DSIM模式采集圖像后發(fā)現(xiàn)Survivin 的位置變化受到紡錘體的控制。Sternemalm［16］將SIM應(yīng)用于小鼠肝臟肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中膜和細(xì)胞骨架聯(lián)系的研究中。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血流和周?chē)M織中的物質(zhì)交換，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞有很多大小不等的窗孔，窗孔直徑50 ～200 nm。橋粒是重要的細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，其直徑小于1 μm，細(xì)胞膜間間隙約為35 nm。在3D-SIM 模式下，Sternemalm發(fā)現(xiàn)CSPP-L 位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中橋粒致密斑的位置。2018 年，Pinnington 等［17］通過(guò)SIM 和單分子定位聯(lián)用研究了腫瘤細(xì)胞中樹(shù)突狀偽足的形成機(jī)制。SIM 也被用于植物領(lǐng)域的研究工作中，Lambing［18］用3D-SIM解析了擬南芥減數(shù)分裂過(guò)程中的聯(lián)會(huì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)PCH2 出現(xiàn)在聯(lián)會(huì)復(fù)合物集結(jié)處。

與其他超分辨顯微鏡相比，SIM對(duì)樣品光損傷小、拍攝速度快，因此在活細(xì)胞觀測(cè)中有著優(yōu)勢(shì)。Turnbull等［19］用SIM 研究了細(xì)菌Pseudomonas aeruginosa膜囊泡的形成機(jī)制和功能。細(xì)菌膜囊泡大小為50 ～250 nm，對(duì)3D-SIM觀察到的膜囊泡進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)SIM觀測(cè)到的膜囊泡直徑大小在150 ～300 nm。膜囊泡的產(chǎn)生是快速的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，這對(duì)儀器的穩(wěn)定性和速度要求很高。在3D-SIM 模式下進(jìn)行時(shí)間序列掃描，發(fā)現(xiàn)膜囊泡在細(xì)胞裂解過(guò)程中產(chǎn)生。SIM時(shí)間序列掃描也被用于研究HeLa細(xì)胞中線粒體-溶酶體結(jié)合的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程［20］。在植物領(lǐng)域，SIM 時(shí)間序列掃描已被用于研究擬南芥多個(gè)組織和器官中微管的動(dòng)態(tài)變化，包括微管的形成、分支、生長(zhǎng)和衰退等過(guò)程［21］。

2 結(jié)構(gòu)光照明顯微成像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

結(jié)構(gòu)光照明顯微成像系統(tǒng)DeltaVision OMX SR屬于大型儀器，其構(gòu)造精密，操作步驟較復(fù)雜。合理的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)是開(kāi)展有效實(shí)驗(yàn)教學(xué)的關(guān)鍵。

2.1 理論課程設(shè)計(jì)

首先，在理論課程上對(duì)SIM的成像原理和結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行系統(tǒng)的介紹。在教學(xué)中，讓學(xué)生掌握扎實(shí)的理論知識(shí)是開(kāi)展實(shí)驗(yàn)課程和自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要基礎(chǔ)，充分理解儀器的運(yùn)行原理不僅能幫助學(xué)生更好地學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，還能避免一些不規(guī)范的操作行為。接著，借助多媒體教學(xué)，圖文并茂地介紹SIM在動(dòng)物、植物、微生物、材料科學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用案例，讓學(xué)生明白SIM在科研中的重要作用和應(yīng)用范圍。在教學(xué)PPT中加入大量的顯微拍攝圖像和時(shí)間序列掃描視頻，著重展示結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡圖像、激光掃描共聚焦顯微圖像、寬場(chǎng)圖像之間的區(qū)別。通過(guò)理論課程，讓學(xué)生掌握SIM的原理，了解其應(yīng)用范圍，同時(shí)激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

2.2 實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)

（1）小組教學(xué)。大型精密儀器對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，操作不當(dāng)容易損壞儀器、造成損失。因此，在實(shí)驗(yàn)技術(shù)訓(xùn)練過(guò)程中，宜采取小組為單位的教學(xué)形式，根據(jù)專(zhuān)業(yè)或課題將學(xué)生分組，每組不超過(guò)10 人。小組教學(xué)的優(yōu)點(diǎn)有，①能保證每個(gè)同學(xué)都有動(dòng)手操作的機(jī)會(huì)；②教師能針對(duì)每個(gè)學(xué)生的操作進(jìn)行指導(dǎo)，可以及時(shí)糾正錯(cuò)誤操作；③利于教師維護(hù)儀器。

（2）開(kāi)關(guān)機(jī)教學(xué)。DeltaVision OMX SR硬件組成主要包括電源、激光器、相機(jī)、顯微鏡、圖像采集工作站和圖像處理工作站。大型儀器的開(kāi)關(guān)機(jī)順序復(fù)雜，激光器和相機(jī)等消耗性部件的使用和開(kāi)關(guān)機(jī)要進(jìn)行重點(diǎn)教學(xué)。錯(cuò)誤的開(kāi)關(guān)機(jī)順序會(huì)導(dǎo)致圖像采集失敗，嚴(yán)重的情況會(huì)對(duì)儀器造成損耗。因此，開(kāi)關(guān)機(jī)教學(xué)中要求學(xué)生一定嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，重點(diǎn)記憶激光器、相機(jī)等部件的使用規(guī)范。

（3）鏡油的選擇。SIM 采用結(jié)構(gòu)光照明，使用正確折光率的鏡油才能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，鏡油的選擇至關(guān)重要。DeltaVision OMX SR配有一個(gè)63 ×油鏡（1.42 NA），與常使用的熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡不同，OMX SR 配有18 種不同折射率的鏡油。調(diào)整鏡油的實(shí)驗(yàn)步驟是，首先在3DConventional拍攝模式下采集一張圖像。接著，根據(jù)Orthogonal的分析結(jié)果調(diào)整鏡油。當(dāng)使用最佳折射率的鏡油時(shí)，會(huì)得到上下均勻的光分布圖（見(jiàn)圖1）。調(diào)整鏡油是SIM 拍攝的難點(diǎn)，也是教學(xué)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。在教學(xué)過(guò)程中，盡量使用典型樣品，比如熒光小球等，讓學(xué)生記憶標(biāo)準(zhǔn)的光分布結(jié)果，在技能訓(xùn)練過(guò)程中需要反復(fù)練習(xí)。

圖1 Orthogonal分析中光的對(duì)稱分布

（4）基本技能訓(xùn)練。在教學(xué)中，實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練采用先演示操作，再讓學(xué)生輪流上機(jī)操作的形式。以細(xì)胞樣品實(shí)驗(yàn)教學(xué)為例，實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞樣品用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，Alexa Fluor 488 標(biāo)記微管蛋白，DAPI 和Alexa Fluor 488 的激發(fā)光分別為405 nm和488 nm。

演示操作按以下步驟進(jìn)行：① 選擇3DConventional模式，405 nm和488 nm兩個(gè)熒光通道，熒光灰度值控制在8 000 左右，樣品拍攝厚度為3 μm，每隔0.125 μm采集一張圖像。對(duì)得到的拍攝數(shù)據(jù)進(jìn)行校色和三維最大投影，然后導(dǎo)出3D-Conventional 三維投影的結(jié)果。② 對(duì)3D-Conventional 的原始數(shù)據(jù)依次進(jìn)行Deconvolution 算法處理、校色、三維最大投影，導(dǎo)出Deconvolution 三維投影的結(jié)果。③ 選擇3D-SIM拍攝模式，405 nm和488 nm兩個(gè)光通道，熒光灰度值同樣控制在8 000 左右，樣品拍攝厚度為3 μm，每隔0.125 μm采集一張圖像。對(duì)拍攝數(shù)據(jù)依次進(jìn)行三維重構(gòu)、圖像校色、三維投影，導(dǎo)出3D-SIM 的三維投影結(jié)果。④ 比較分析寬場(chǎng)圖像、Deconvolution 圖像和SIM圖像之間的差別，讓學(xué)生體會(huì)不同拍攝模式得到圖像分辨率的差別。比如，圖2 所示的結(jié)果顯示Conventional、Deconvolution 和SIM 均觀測(cè)到細(xì)胞核和微管的結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)SIM 圖像中細(xì)胞核和微管結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)最清楚，圖像分辨率和質(zhì)量最高，其次是Deconvolution 的圖像。Conventional 的圖像有明顯光暈。

圖2 微管和細(xì)胞核的三維投影顯微圖像

在演示教學(xué)之后，讓學(xué)生輪流進(jìn)行操作練習(xí)。大型儀器操作步驟多，學(xué)生需要反復(fù)練習(xí)才能熟練掌握。練習(xí)過(guò)程中老師全程陪同，對(duì)拍攝中的問(wèn)題進(jìn)行及時(shí)指導(dǎo)教學(xué)，直到學(xué)生能完成完整的實(shí)驗(yàn)操作，采集到滿意的圖像。

（5）開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)。為了充分調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，同時(shí)增加教學(xué)內(nèi)容的豐富性和靈活性，教學(xué)設(shè)計(jì)中加入了開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)教學(xué)面向研究生開(kāi)展，在實(shí)驗(yàn)課前1 周通知學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、準(zhǔn)備樣品。在掌握基本實(shí)驗(yàn)技能的基礎(chǔ)上，讓學(xué)生根據(jù)自己的樣品選擇合適的拍攝模式，獨(dú)立設(shè)計(jì)拍攝方案，并獨(dú)立操作儀器。常見(jiàn)的拍攝樣品類(lèi)型包括細(xì)胞樣品、組織切片和高分子材料等，OMX SR 配備的4 個(gè)激光光源能滿足學(xué)生使用的熒光染料或標(biāo)記物的激發(fā)光要求。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，如果遇到問(wèn)題，遵循先引導(dǎo)學(xué)生分析原因，再指導(dǎo)其制定解決方案的原則。最后將總結(jié)歸納的內(nèi)容及時(shí)反饋給學(xué)生，幫助學(xué)生改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案。

（6）課程考核。考核與評(píng)價(jià)是實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的重要組成部分，是檢驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量、教授與學(xué)習(xí)效果的有效手段。為了全面科學(xué)地評(píng)價(jià)學(xué)生的實(shí)踐能力和綜合素質(zhì)，本教學(xué)方案將多元化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)課程考核的內(nèi)容?？己藘?nèi)容包括課堂出勤、實(shí)驗(yàn)技能測(cè)試、自主實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫(xiě)。實(shí)驗(yàn)課的目的不只是掌握儀器的使用操作，更重要的是提高提出問(wèn)題、分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力。因此，實(shí)驗(yàn)報(bào)告除了記錄實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、操作步驟和數(shù)據(jù)之外，還增加了數(shù)據(jù)分析和討論兩部分內(nèi)容。

3 討 論

熒光顯微鏡是生命科學(xué)研究中的重要工具，具有直觀性、特異性和可觀測(cè)活細(xì)胞等特點(diǎn)。然而，熒光顯微鏡分辨率的提高受到光衍射極限的限制。與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率有了較大的提升，該顯微鏡利用共軛針孔技術(shù)減少了非焦平面的信息。依賴激發(fā)波長(zhǎng)，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率可達(dá)x y軸230 nm，z軸500 nm［22-24］。但是隨著科學(xué)研究的深入，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率已不能滿足科學(xué)家們對(duì)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)等研究的要求。到20 世紀(jì)末，科學(xué)家們相繼提出了突破衍射極限的光學(xué)顯微成像方法，超高分辨顯微鏡的概念被提出來(lái)，這給顯微鏡和科學(xué)研究的發(fā)展帶來(lái)了突破性的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加入超高分辨顯微鏡中結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡的內(nèi)容是緊跟科研發(fā)展的選擇，這樣不僅使教學(xué)可以更好地服務(wù)于科研工作，還可以幫助學(xué)生拓寬知識(shí)面、提升綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

大型精密儀器具有操作復(fù)雜，維護(hù)成本高等特點(diǎn)，這使其實(shí)驗(yàn)教學(xué)多局限于演示教學(xué)。在超高分辨顯微鏡的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)上采用小組教學(xué)的形式，教師全程指導(dǎo)、嚴(yán)格要求、規(guī)范操作，給每個(gè)學(xué)生提供上機(jī)操作的機(jī)會(huì)。教學(xué)設(shè)計(jì)上由淺入深，重視對(duì)儀器原理的講解，掌握扎實(shí)的理論基礎(chǔ)有助于學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。通過(guò)設(shè)置開(kāi)放性試驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手操作與獨(dú)立思考的能力。開(kāi)放實(shí)驗(yàn)樣品類(lèi)型多樣，在圖像采集、參數(shù)設(shè)置等過(guò)程能夠進(jìn)行有針對(duì)性的分析教學(xué)，這樣增加了課程的靈活性、趣味性和實(shí)用性。在教學(xué)中注重經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和反饋教學(xué)。比如在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)學(xué)生制備的樣品存在統(tǒng)一的問(wèn)題，蓋片上有多余封片劑等污染物，蓋片位置靠近載玻片邊緣從而影響觀察等。教學(xué)中應(yīng)把學(xué)生在樣品制備和實(shí)驗(yàn)操作中常見(jiàn)的錯(cuò)誤進(jìn)行總結(jié)歸納，并在課程中作為重點(diǎn)進(jìn)行講解。此外，小組教學(xué)給師生間提供了更多的交流機(jī)會(huì)，學(xué)生思維活躍，在課堂中會(huì)提出新想法或問(wèn)題，這對(duì)教師的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰椭R(shí)面提出了更高的要求，直接促進(jìn)了教師的自主學(xué)習(xí)和提升。

4 結(jié) 語(yǔ)

在“雙一流”建設(shè)的目標(biāo)下，著力建設(shè)了顯微成像儀器的共享平臺(tái)，并盡力做到科研教學(xué)并重。超高分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡在生命科學(xué)領(lǐng)域有著重要的作用，該顯微鏡已被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)、蛋白精確定位和活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)等研究中。在實(shí)驗(yàn)課程中加入大型精密儀器的理論和實(shí)踐教學(xué)具有很強(qiáng)的實(shí)用性，同時(shí)對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰蛣?chuàng)新性思維也有著積極的促進(jìn)作用。