活性氧檢測熒光探針的設計、合成及應用研究進展

尹佳薈， 張淑平

（上海理工大學 理學院，上海 200093）

生物體氧化還原反應及其動態(tài)平衡對生物體細胞的增殖、凋亡具有重要影響。細胞本身擁有一系列氧化物質與還原物質，健康的細胞能夠實現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡。但當細胞受到外界刺激或發(fā)生病變時，該動態(tài)平衡過程將會被打破。當細胞產生大量氧化性物質時，如活性氧、活性氮等，細胞會發(fā)生氧化應激；同時細胞又依靠一系列還原性物質來保持其具有一定的拮抗氧化能力，如還原型谷胱甘肽、NADPH等，但當還原性物質過量表達時，細胞則會發(fā)生還原應激。生物體氧化還原狀態(tài)的失衡會嚴重影響生物體的正常生理功能[1]。因此，對細胞氧化還原反應的動態(tài)監(jiān)測具有重要意義。目前，熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好、方法簡便、檢出限低等優(yōu)點，受到了眾多研究人員的關注。

本文介紹了生物體氧化應激的產生原因及影響，分析了各類活性氧檢測的熒光探針構成及應用，為設計新型活性氧檢測熒光探針的設計提供了指引思路。

1 生物體氧化應激的概述

生物體處于正常生理狀態(tài)時，其細胞內的氧化還原狀態(tài)將處于動態(tài)平衡。但當生物體某些結構發(fā)生病變時，細胞內的氧化性物質過量表達，將會導致機體發(fā)生氧化應激。氧化應激反應是生物體或細胞內的氧化性物質的過度積累或外源性氧化物質的過量攝入所導致的蓄積現(xiàn)象[2]。機體傾向于氧化，會導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，促進大量氧化中間產物的產生。生物體內的氧化性物質主要由氧自由基ROS構成，約占整體自由基的95%，此外還包括氮自由基、碳自由基?；钚匝踝杂苫饕ㄒ韵聨追N：過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（）、羥基自由基（-OH）、單線態(tài)氧（1O2）和次氯酸（HClO）等?；钚匝踝杂苫倪^度表達與多種疾病的產生息息相關，如癌癥、心腦血管疾病、風濕性關節(jié)炎等。

2 各類活性氧物質的測定

生物體內的活性氧自由基主要包括以下幾種：過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（）、羥基自由基（-OH）、單線態(tài)氧（1O2）和次氯酸（HClO）等。近年來針對各種活性氧檢測的熒光探針得到了迅猛的發(fā)展。以下對幾種重要的活性氧自由基的測定進行介紹。

2.1 過氧化氫（H2O2）的測定

過氧化氫是一類重要的活性氧自由基，人體中幾乎所有的細胞都含有過氧化氫。過氧化氫作為活性氧自由基的重要一員，對生物的多種生理過程都具有一定的調節(jié)作用。一方面，過氧化氫自由基與細胞的遷移、增殖、分化息息相關[3]，此外，它還可以有效調節(jié)人體的免疫防御機制。一定量的過氧化氫對生物體是有益的，但當其數(shù)量超過一定限度并在體內積聚時，會對生物體細胞內的蛋白、核酸、脂質大分子等造成氧化損傷，進而會引起衰老、糖尿病、癌癥等多種疾病[4]。

2004年，Chang課題組開發(fā)了第一代具有雙芳基硼酸酯結構的熒光探針（PF1）[5]。當該探針與H2O2特異性結合時，探針上的硼酸酯鍵被水解成酚，原探針本身具有微弱的熒光，在與 H2O2反應后，熒光強度大大增強。但探針本身具有的兩個芳基硼酸酯，顯著降低了開啟響應動力學，使得靈敏度顯著降低。第二代探針（PF2）[6]利用單個硼酸酯手柄與H2O2反應，更快地積累熒光信號，從而提高了該探針的靈敏度，并首次實現(xiàn)了對內源性H2O2的檢測，但單硼酸酯結構對探針背景熒光的抑制能力減弱。2019年，Jun Liu等[7]在此基礎上，開發(fā)了一種新型熒光探針，運用雙淬滅概念，將可消除的深色淬滅劑4-二甲基氨基偶氮苯-4’-羧酸引入第二代探針，并用可靶向定位線粒體的墨菲磷陽離子修飾，一方面降低了該探針的背景熒光，另一方面實現(xiàn)了亞細胞器（線粒體）內H2O2的靶向定位。

圖1 過氧化氫（H2O2）檢測熒光探針

2.2 超氧陰離子（）的測定

超氧陰離子作為人體新陳代謝的活性中間體，對生物體具有重要意義。超氧陰離子氧化活性高、濃度低、壽命短，是細胞中大多數(shù)ROS的前體[8]。一定量的超氧陰離子可以維持生物體的正常代謝，但其過量可導致組織損傷。因此，設計開發(fā)具有動態(tài)檢測超氧陰離子的熒光探針已成為了一項重要課題。

2018年，Haibin Xiao等[9]開發(fā)出一種靶向定位ER的熒光探針ER-NAPC，用來檢測超氧陰離子。如圖2所示，ER-NAPC由熒光團1,8-萘二甲酰亞胺、超氧陰離子識別基團咖啡酸基團以及ER靶向部分甲基黃酰胺組成。該探針對超氧陰離子的識別基于 FRET效應，探針上的咖啡酸基團與結合，從鄰苯二酚氧化為醌，整個體系發(fā)出強烈的熒光。2019年，Ning Zhang等[10]開發(fā)出一種用于檢測的新型線粒體靶向比率型熒光探針。該探針利用誘導二苯基次膦酸脂的脫保護作用，將具有藍色熒光的PBD-B探針轉化為具有綠色熒光的染料PBD-G。該探針在發(fā)揮作用時，綠色（F540）熒光和藍色（F475）熒光之間的發(fā)射強度之比（F540 / F475）會隨著超氧陰離子濃度的增加而增加。

圖2 超氧陰離子（）檢測熒光探針圖

2.3 羥基自由基（-OH）的測定

羥基自由基是一種高活性基團，具有一個未成對電子，由氫氧根失去一個電子形成，具有極強的氧化能力。羥基自由基作為活性氧的一種，主要在細胞內線粒體電子傳遞過程中形成，線粒體的髓過氧化物酶可催化O2生成-OH。

近年來，BODIPY染料由于其具有良好的化學穩(wěn)定性，較高的熒光量子產率而受到廣泛關注。2017年Kepeng Lei課題組[11]開發(fā)出基于BODIPY熒光團的探針OHP。OHP探針的最大發(fā)射波長為514 nm，當探針與羥基自由基結合后，可通過非氧化還原機制有效淬滅熒光，生成不具有熒光的分子。該探針可以特異性地識別羥基自由基，細胞毒性低，并且具有良好的生物相容性，可用于細胞活體成像。2019年，Xin Wang等[12]開發(fā)了一種基于分子內電荷轉移機理（ICT）的熒光探針 MD-B，該探針以帶有三氟甲基的香豆素為熒光團，以3-甲基吡唑啉酮為識別基團。三氟甲基作為強吸電子基團，增強了香豆素共軛物的推拉電子效應。探針中羰基直接附著在氮原子上，從而減弱了香豆素的推拉電子效應。當探針與羥基自由基結合后，MD-B迅速通過單電子氧化作用形成MD-B-OH。在MD-B-OH中，羰基遠離香豆素環(huán)，香豆素環(huán)的推拉電子效應得以恢復，從而產生了強的熒光。

圖3 羥基自由基（-OH）檢測熒光探針圖

2.4 次氯酸（HClO）的測定

次氯酸是一種不穩(wěn)定的弱酸。在生物體內，過氧化氫和氯離子通過髓過氧化物酶（MPO）的催化作用，產生次氯酸[13]。細胞內次氯酸的濃度與生物體的健康息息相關。HClO具有出色的氧化能力，因此它可以作為重要的抗菌劑，殺死生物系統(tǒng)中的侵入性細菌病原體[14]。但次氯酸濃度超過一定限度時，會導致機體組織損傷和多種疾病。因此，對次氯酸的動態(tài)檢測已成為一重要課題。

2007年，Kenmoku、Suguru等[15]基于四甲基羅丹明（TMR）在水性介質中良好的光學特性，通過調節(jié)螺環(huán)化作用，開發(fā)出一種可以特異性檢測次氯酸的新型探針HySOx。該探針含有螺環(huán)硫醚環(huán)，耐空氣氧化，可與次氯酸反應生成開環(huán)的氧雜蒽亞硫酸鹽HySO3H。2011年，Xiaoqiang Chen等[16]在此基礎上，開發(fā)了一系列用于檢測次氯酸探針 R19S、R19Se、R101S。其中，R19S具有最佳的選擇性與靈敏度。R19S本身具有的環(huán)狀結構與次氯酸發(fā)生反應形成R19S-Cl中間體，隨后水解形成R19羧酸，并產生熒光。該探針可被用于檢測人體多形核中性粒細胞中的次氯酸根。2015年，Jin Zhou等[17]在R19S探針的基礎上，引入可靶向定位線粒體的墨菲磷陽離子結構，開發(fā)出了具有線粒體靶向定位功能用于檢測次氯酸根離子的熒光探針RSTPP。

圖4 次氯酸（HClO）檢測熒光探針圖

2.5 單線態(tài)氧（1O2）的測定

單線態(tài)氧即激發(fā)態(tài)的氧分子。正常情況下，人體內的單線態(tài)氧含量是極低的，并且處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當單線態(tài)氧含量超過一定水平時，它能和許多生物分子反應 ，如單線態(tài)氧可穿透線粒體膜或核膜，對DNA造成損傷；單線態(tài)氧也可與蛋白分子反應，使蛋白質喪失功能。單線態(tài)氧對生物體來說是一把雙刃劍，如卟啉病的形成就是由于人體中過多的血卟啉經光照而產生1O2，由于其較高的氧化性，從而對細胞及組織造成損傷[18]；另一方面，1O2是人體中的一種重要殺菌劑，還可用于癌癥的光動力治療[19]。

蒽及其衍生物由于其可以特異性的結合1O2一直備受關注。2018年，Mingtai Sukn等[20]設計了一系列應該探針 P1、P2、P3。該系列探針選擇了兩種不同的熒光團，并與蒽甲基識別基團相連。當探針與 1O2反應時，引發(fā)C-C鍵斷裂，打破PET效應，產生熒光。這一系列探針只需一步替換反應就可輕松制得。該系列探針顯示出低細胞毒性，可用于細胞成像。同年，Ricardo Flores-Cruz 等[21]設計了一種新型熒光探針RC334，能夠監(jiān)測線粒體內光動力（PDT）產生的細線粒體單線態(tài)氧（1O2）。這種探針在于單線態(tài)氧反應后，還可以通過微分細胞器（線粒體-核仁）的分布來監(jiān)測其變化。研究發(fā)現(xiàn)亞細胞RC334熒光分布取決于1O2的局部變化。探針與1O2反應后，香豆素部分形成并釋放到細胞中，引起相應的核仁共定位。

圖5 單線態(tài)氧（1O2）檢測熒光探針作用機理圖

3 總結和展望

迄今為止，熒光分析技術在各類活性氧物質檢測中得到了廣泛認可，這一技術同時在分析化學、臨床生物化學、醫(yī)藥和環(huán)境領域中展現(xiàn)出巨大的潛力。但是，這一技術的發(fā)展仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，目前開發(fā)出的熒光探針分子在穩(wěn)定性、專一性、溶解性、生物毒性、組織穿透能力等方面還存在不足之處，難以滿足活體成像的要求。因此，為了滿足生物體內活性氧物質的實時動態(tài)檢測，仍需進行更加深入的研究，不斷發(fā)展創(chuàng)新。