球等鞭金藻中巖藻黃素的提取及其純化工藝研究

陳建楠 陳由強(qiáng) 薛婷

摘?要：以球等鞭金藻藻粉為原料，研究了球等鞭金藻中的巖藻黃素有機(jī)溶劑提取條件工藝優(yōu)化、硅膠層析柱分離純化和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀定性分析。主要通過(guò)單因素試驗(yàn)法和正交優(yōu)化法確定了提取條件的工藝優(yōu)化參數(shù)，硅膠層析柱分離純化巖藻黃素，并通過(guò)超高效液相色譜（UPLC）定量檢測(cè)和LCQ Fleet 離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀定性分析巖藻黃素。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝為提取溫度35℃、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間15 min、提取次數(shù)2次，巖藻黃素的提取率達(dá)到12.03 mg·g-1。硅膠層析柱分離純化后最佳回收率為86.35%，純度為29.78%，LCQ Fleet 離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀定性分析質(zhì)量分?jǐn)?shù)為659.0902。本研究結(jié)果為工業(yè)化快速提取球等鞭金藻中的巖藻黃素活性物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻;巖藻黃素;提取工藝;純化

中圖分類(lèi)號(hào)：S963?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）04-0028-10

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.005

Study on the Extraction and Purification Process of Fucoxanthin in Isochrysis Galbana

CHEN Jian?Nan1，2， CHEN You?qiang1，2， XUE Ting1，2*

（1.College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;

2.Southern Institute of Oceanography， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： By taking Isochrysis galbana powder as the raw material， the process optimization of extraction conditions with the organic solvent of fucoxanthin in Isochrysis galbana， the separation and purification by silica column chromatography， and the qualitative analysis by UPLC?GC?MS were studied in this paper. The process optimization parameters of extraction conditions were determined mainly by the methods of single factor test and orthogonal optimization， and then the fucoxanthin was separated and purified by silica column chromatography. Last， the fucoxanthin was quantitatively detected by UPLC and qualitatively analyzed by LCQ Fleet. The results showed that the optimum extraction process was as follows： the extraction temperature was 35℃， the solid?liquid ratio was 1∶30（g/mL）， the extraction time was 15 min， and the extraction times were twice. Under these conditions， the extraction rate of fucoxanthin reached 12.03 mg·g-1， the optimal recovery rate was 86.35% and the purity was 29.78% after the separation and purification by silica column chromatography， and the mass fraction qualitatively analyzed by LCQ Fleet was 659.0902. The results of this study provided a theoretical basis for the rapid industrial extraction of the active substance of fucoxanthin from Isochrysis galbana.

Key words： Isochrysis galbana; Fucoxanthin; Extraction process; Purification

球等鞭金藻Isochrysis galbana[1-3]是一種富含巖藻黃素的海洋單細(xì)胞微藻，沒(méi)有細(xì)胞壁，藻體形態(tài)為橢圓形或球形，具有兩根等長(zhǎng)的鞭毛。巖藻黃素（fucoxanthin）[4-5]分子式為C42H58O6，相對(duì)分子質(zhì)量為658.91，密度為（1.1±0.1）g·cm-3，熔點(diǎn)在166～168℃范圍間，沸點(diǎn)在（786.5±60.0）℃ ，紫外可見(jiàn)光光譜在447～450 nm，其主要通過(guò)液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)。巖藻黃素是一種紅褐色無(wú)氣無(wú)味的粉末結(jié)晶狀物質(zhì)，主要來(lái)源于海洋大型海藻褐藻和海洋微藻[5-6]。巖藻黃素分子結(jié)構(gòu)式中含有1個(gè)多烯烴骨架-丙二烯型類(lèi)胡蘿卜素，5，6

單環(huán)氧基，9共軛雙鍵，還含有有羰基和羥基[4]。巖藻黃素分子結(jié)構(gòu)式中含有共軛雙鍵，所以可能存在其他的同分異構(gòu)現(xiàn)象，ZHANG等[7]從褐藻植物中分離純化到3種同分異構(gòu)體的巖藻黃素，9′Z、13Z和13′Z不同類(lèi)型的巖藻黃素異構(gòu)體。巖藻黃素具有抗氧化活性和清除自由基能力[7-8]，XIA等[9]從海洋硅藻中提取出巖藻黃素，通過(guò)測(cè)定抗氧化活性來(lái)研究巖藻黃素對(duì)DPPH 和ABTS自由基團(tuán)具有很強(qiáng)的清除能力。NISHINO等[10]通過(guò)巖藻黃素對(duì)DPPH、12-DS和NB-L各自由基團(tuán)清除能力的電子信號(hào)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)清除DPPH自由基能力要比清除12-DS和NB-L自由基的強(qiáng)。巖藻黃素具有抗血管新生和多種保護(hù)預(yù)防活性，SUGAWARA等[11]通過(guò)巖藻黃素對(duì)人體靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)巖藻黃素具有抑制內(nèi)皮組細(xì)胞分化生成新的內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到抗血管新生作用。巖藻黃素具有抗肥胖和抗腫瘤活性，HOSOKAWA等[12]通過(guò)巖藻黃素培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了巖藻黃素具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞的DNA斷裂，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，降低癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的功能。

巖藻黃素是脂溶性色素，易溶于有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇、二甲基亞砜、丙酮、正己烷、石油醚和乙酸乙酯等[5-6]。巖藻黃素提取的主要方法有機(jī)溶劑浸提法、CO2超臨界萃取技術(shù)、微波萃取法和超聲波提取法等[5]。有機(jī)溶劑提取微藻中的巖藻黃素，其主要利用有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、丙酮或者混合有機(jī)溶劑甲醇∶丙酮（2∶1）等對(duì)藻體中色素的進(jìn)行溶解萃取，其方法簡(jiǎn)單效果好，在國(guó)內(nèi)外被廣泛使用。Kim等[13]通過(guò)對(duì)三角褐指藻中提取巖藻黃素，得到了最佳的提取條件為有機(jī)溶劑乙醇為最佳提取溶劑，提取溫度為40℃，料液比為1∶6，提取時(shí)間為12 h。Wang等[14]通過(guò)二甲基亞砜浸泡海帶，再用含有硫酸銨的乙酸乙酯對(duì)巖藻黃素進(jìn)行萃取。尹尚軍等[15]通過(guò)甲醇乙醇的混合溶劑對(duì)羊棲菜進(jìn)行巖藻黃素提取，其料液比在1∶40，溫度在65℃下水浴振蕩提取2次，提取率可達(dá)1.067 mg·g-1。Roh等[16]通過(guò)超臨界CO2萃取技術(shù)將巖藻黃素從裙帶菜中提取出來(lái)，其得到最佳提取工藝為3%乙醇為夾帶劑，壓力為20 MPa，溫度為49.85℃。XIAO等[17]通過(guò)微波萃取技術(shù)在褐藻海帶中提取巖藻黃素，并且對(duì)各提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最優(yōu)的微波提取條件。陳文佳[18]通過(guò)超聲波輔助對(duì)海帶中的巖藻黃素進(jìn)行提取條件的工藝優(yōu)化，得出了最佳的提取工藝參數(shù)：加入1%的壞血酸、料液比為1∶45、提取溫度為60℃、超聲波處理30 min提取2次，提出率為0.4417 mg·g-1。巖藻黃素的分離純化方法主要是通過(guò)硅膠柱層析技術(shù)、制備型高效液相色譜法、薄層層析色譜法、離心分配色譜技術(shù)[19]和高速逆流色譜法等。薄層層析色譜法分離巖藻黃素是探究層析液對(duì)巖藻黃素的分離效果，從而選定為接下來(lái)的柱層析分離[20-21]。硅膠柱層析的原理是通過(guò)不同物質(zhì)在硅膠顆粒上吸附力的不同而得到分離[5，19]。SUDHAKAR等[22]通過(guò)硅膠柱層析將褐藻海帶中的巖藻黃素進(jìn)行分離純化，洗脫液為正己烷∶丙酮（7∶3）混合液。周衛(wèi)松等[5]通過(guò)硅膠柱層析分離純化海帶中的巖藻黃素，分離純化得到的純度為24.2%，回收率可達(dá)90.9%。HOSOKAWAM等[23]通過(guò)硅膠柱分離純化裙帶菜粗提物里的巖藻黃素，其洗脫液為正己烷∶丙酮（6∶4）進(jìn)行洗脫。

本研究主要通過(guò)有機(jī)溶劑浸提法對(duì)球等鞭金藻中巖藻黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以及硅膠柱層析技術(shù)分離純化巖藻黃素，進(jìn)一步采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀定性分析巖藻黃素，為后續(xù)工業(yè)化快速提取球等鞭金藻中的巖藻黃素活性物質(zhì)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?主要試劑材料

1.1.1?藻粉來(lái)源?球等鞭金藻藻粉：實(shí)驗(yàn)室光生物反應(yīng)器通氣培養(yǎng)，離心凍干收集。

1.1.2?試驗(yàn)試劑?無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亞砜等試劑均為國(guó)藥分析純。色譜純乙腈、色譜純甲醇購(gòu)于德國(guó)默克，色譜純甲酸購(gòu)于阿拉丁。巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma?Aldrich。硅膠板、硅膠柱、硅膠粉200～300目等。

1.1.3?試驗(yàn)儀器?光生物反應(yīng)器（上海光語(yǔ)生物科技有限公司），超純水機(jī)（美國(guó)密理博Milli?Q Academic），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52A（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，超高效液相色譜（ACQUITY UPLCTM新加坡沃特斯公司），凍干機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，液相質(zhì)譜Thermo ScientificTM LCQ FleetTM[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]等。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?原料來(lái)源的預(yù)處理?將球等鞭金藻培養(yǎng)在50 L的光生物反應(yīng)器至指數(shù)生長(zhǎng)期后期，8000 r·min-1冷凍離心收集藻泥，用蒸餾水洗滌3次，放置-80℃冰箱預(yù)冷24 h，轉(zhuǎn)至冷凍干機(jī)48 h凍干。凍干后將球等鞭金藻碾成粉末狀，稱(chēng)重分裝。

1.2.2?超高效液相色譜UPLC檢測(cè)條件?檢測(cè)條件：PDA Detector光電二極管矩陣檢測(cè)器。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm色譜柱以及配套保護(hù)柱。流動(dòng)相：A2色譜純乙腈（0.05%甲酸）和B1超純水（0.05%甲酸）梯度洗脫：0～4 min A2（65%～100%）B1（0～35%），4～7 min A2（100%），7～8 min A2（65%）B1（35%），8～12 min A2（65%）B1（35%）。吸光度：447 nm（巖藻黃素標(biāo)品先經(jīng)過(guò)UPLC 的PDA Detector光電二極管矩陣檢測(cè)器400～600 nm全波段掃描，波長(zhǎng)在447 nm處對(duì)巖藻黃素標(biāo)品有最大吸收峰值）。流動(dòng)相流速：0.25 mL·min-1。色譜柱溫度：40℃。樣品室溫度：25℃，進(jìn)樣量：2 μL，進(jìn)樣時(shí)間12 min。

1.2.3?巖藻黃素的提取條件優(yōu)化?（1）不同有機(jī)溶劑對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉20 mg分裝于棕色2 mLEP管中，分別加入1 mL的有機(jī)溶劑甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亞砜、甲醇∶丙酮（1∶1）8種有機(jī)溶劑，每種溶劑各設(shè)置3個(gè)平行，蓋上蓋子，放置在暗光里浸提1 h。浸提期間把EP管上下顛倒搖勻3次，以便溶劑浸提色素更充分。浸提完成，用高速冷凍離心機(jī)12000 r·min-1離心10 min，收集上清液，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)UPLC檢測(cè)其巖藻黃素含量。（2）提取溫度對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉20 mg分裝于棕色2 mLEP管中，加入1 mL的有機(jī)溶劑甲醇（由不同有機(jī)溶劑提取球等鞭金藻巖藻黃素篩選出），分別置于預(yù)先設(shè)好冰浴上，分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃（溫度不宜設(shè)置太高，巖藻黃素對(duì)溫度和光敏感）水浴鍋上，每組3個(gè)平行，蓋上鍋蓋子避光浸提1 h。浸提期間快速拿出來(lái)上下顛倒搖勻3次。浸提完成，用高速冷凍離心機(jī)12000 r·min-1離心10 min，收集上清液，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)UPLC檢測(cè)其巖藻黃素含量。（3）料液比對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉50 mg分裝于棕色2 mLEP管中，分別加入1∶10、1∶15、1∶20、1∶

25、1

∶30、1∶35（g/mL）的料液比有機(jī)溶劑甲醇，每組3個(gè)平行試驗(yàn)，蓋上蓋子避光浸提1 h，提取溫度為35℃。浸提期間快速拿出來(lái)上下顛倒搖勻3次。浸提完成，用高速冷凍離心機(jī)12000 ?r·min-1離心10 min，收集上清液，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)UPLC檢測(cè)其巖藻黃素含量。（4）提取時(shí)間對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉20 mg分裝于棕色2 mLEP管中，加入料液比為1∶30（g/mL），有機(jī)溶劑甲醇，分別設(shè)置浸提時(shí)間為15、30、60、90、120 min，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，提取溫度為35℃。浸提期間快速拿出來(lái)上下顛倒搖勻3次。浸提完成，用高速冷凍離心機(jī)12000 r·min-1離心10 min，收集上清液，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)UPLC檢測(cè)其巖藻黃素含量。（5）提取次數(shù)對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉20 mg分裝于棕色2 mL EP管中，加入料液比為1∶30（g/mL），有機(jī)溶劑甲醇，分別設(shè)置提取次數(shù)為1、2、3次[提取完再加入料液比為1∶30（g/mL）有機(jī)溶劑甲醇]。每組試驗(yàn)3個(gè)平行，提取時(shí)間為1 h，提取溫度為35℃。浸提期間快速拿出來(lái)上下顛倒搖勻3次。浸提完成，12000 r·min-1離心10 min，合并收集上清液，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)UPLC檢測(cè)其巖藻黃素含量。

1.2.4?巖藻黃素提取工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)?通過(guò)對(duì)球等鞭金藻有機(jī)溶劑提取巖藻黃素的各提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取巖藻黃素的主要提取因子：提取溫度、提取時(shí)間、料液比，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)（為了減少誤差設(shè)置了一列空列D），表1為L(zhǎng)9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素與水平，表2為L(zhǎng)9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表。

1.2.5?巖藻黃素分離純化試驗(yàn)?（1）硅膠板薄層層析定性分析。硅膠薄層層析板定性分析（TLC）：先將300目硅膠薄層層析板放置在100℃烘箱里烘干，烘干后取出硅膠板放置在水平臺(tái)面上，冷卻至室溫。在硅膠板底端1 cm處用鉛筆劃上一條橫線(xiàn)，并在線(xiàn)上左右各標(biāo)上2個(gè)點(diǎn)，方便點(diǎn)樣。吸取3 μL球等鞭金藻巖藻黃素提取液點(diǎn)樣于線(xiàn)上的右點(diǎn)處，左側(cè)點(diǎn)點(diǎn)樣巖藻黃素標(biāo)品3 μL，標(biāo)品和提取液濃度不能太高。待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后，放入預(yù)先配好的層析液層析缸中，進(jìn)行跑樣。由于球等鞭金藻提取液是提取的總色素，自帶顏色，很好觀察，無(wú)需噴顯色劑。本研究主要參考國(guó)內(nèi)外發(fā)表的一些文獻(xiàn)，分離純化巖藻黃素的層析液，初步選定乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇（3∶2∶1）、正己烷∶甲醇（3

∶2）、正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（3∶2∶1）、正己烷∶丙酮（3

∶2）作為層析液進(jìn)行跑樣，再根據(jù)跑樣的效果進(jìn)行濃度梯度適當(dāng)變化。（2）硅膠柱層析分離純化巖藻黃素。準(zhǔn)確稱(chēng)取球等鞭金藻藻粉1 g重新放入50 mL的離心管中，離心管外用錫箔紙包起來(lái)，加入30 mL甲醇，再加入1‰左右的MgCO3粉末防止氧化，在35℃水浴下避光浸提15 min，期間拿出來(lái)上下顛倒混勻3次，浸提2次。浸提完成，12000 r·min-1離心10 min合并收集上清液，取100 μL稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)UPLC液相色譜檢測(cè)含量。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL左右的總色素和加入硅膠粉吸附濃縮得到總色素粉末。

硅膠柱準(zhǔn)備階段：先將200～300目大小的硅膠粉在100℃烘箱里過(guò)夜烘干，架起直徑為5 cm長(zhǎng)度為60 cm的帶砂底的層析柱，將烘干的硅膠粉均勻地往層析柱里裝，一次性裝到層析柱的2/3處，裝柱期間不能停，要一次性裝好柱，防止硅膠粉斷層。再加入洗脫液正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（9∶2∶1）高于柱子里的硅膠層，讓洗脫液充滿(mǎn)硅膠柱里的硅膠粉，再用洗脫液進(jìn)行洗脫8 h或者過(guò)夜洗脫，洗脫液洗脫后液面要?jiǎng)偤昧粼诠枘z層析柱里的硅膠粉層，分別加入球等鞭金藻提取濃縮液總色素和硅膠粉末濃縮吸附的總色素，加入后再蓋上一層2～3 cm的硅膠粉。通過(guò)洗脫液正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（9∶2∶1）進(jìn)行室內(nèi)避光洗脫。洗脫后，收集最后出來(lái)橙褐色的巖藻黃素層，分裝在棕色瓶子里。再通過(guò)40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至巖藻黃素粉末，再稱(chēng)重，甲醇溶解，取微量再稀釋適宜濃度通過(guò)UPLC檢測(cè)其濃度，再計(jì)算含量和分離純化的純度。

1.2.6?高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀定性分析?將球等鞭金藻巖藻黃素經(jīng)過(guò)硅膠層析柱分離純化后的樣品和溶解于色譜純甲醇中巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜裝于棕色液相進(jìn)樣瓶中，再通過(guò)美國(guó)Thermo ScientificTM LCQ FleetTM LCMS質(zhì)譜儀檢測(cè)鑒定分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?巖藻黃素的提取條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1?不同有機(jī)溶劑對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響?通過(guò)不同有機(jī)溶劑甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亞砜、甲

醇∶丙酮（1∶1）8種有機(jī)溶劑對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響試驗(yàn)，不同溶劑的提取率如圖1所示，發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑丙酮對(duì)球等鞭金藻的提取率最高，其次是甲醇，兩者相差不大，氯仿和石油醚提取率最低，不適合作為巖藻黃素提取溶劑?？紤]到丙酮屬于易制毒易制爆危險(xiǎn)品，毒性大，易致癌，易揮發(fā)，對(duì)人體危害大，不適合作為工廠(chǎng)化提取球等鞭金藻巖藻黃素的有機(jī)溶劑，所以選用了甲醇作為最適提取溶劑。

2.1.2?提取溫度對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響?通過(guò)不同提取溫度對(duì)巖藻黃素提取率的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)提取溫度逐漸升高其巖藻黃素的提取率也逐漸升高，提取溫度在35℃和40℃時(shí)，提取率變化不大，如圖2所示，考慮到溫度對(duì)巖藻黃素的敏感性，溫度越高巖藻黃素越容易變性，所以選擇35℃作為后續(xù)試驗(yàn)中巖藻黃素提取最適溫度。

2.1.3?料液比對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響?通過(guò)不同料液比對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了隨著料液比率的升高，球等鞭金藻巖藻黃素的提取率越高，如圖3所示，料液比1∶30時(shí)，巖藻黃素的提取率達(dá)到最高，所以在后續(xù)試驗(yàn)中選擇料液比 1∶30（g/mL）作為球等鞭金藻巖藻黃素提取的料液比。

2.1.4?提取時(shí)間比對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響?通過(guò)不同提取時(shí)間對(duì)巖藻黃素提取率的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了球等鞭金藻巖藻黃素的提取率在提取時(shí)間60 min時(shí)和90 min、120 min的提取率基本相同，如圖4所示。所以在后續(xù)試驗(yàn)里選擇60 min作為最適提取時(shí)間。

2.1.5?提取次數(shù)比對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響?通過(guò)不同提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素提取率的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)浸提2次基本能夠把球等鞭金藻中的巖藻黃素提取出來(lái)，浸提2次與浸提3次的提取率基本相同。如圖5所示，所以選擇浸提次數(shù)為2次為最佳的提取次數(shù)。

2.2?巖藻黃素提取工藝正交優(yōu)化結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)對(duì)球等鞭金藻有機(jī)溶劑提取巖藻黃素的各提取條件的單因素試驗(yàn)后，選取巖藻黃素的主要提取因子進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，其正交試驗(yàn)結(jié)果如圖表3所示，從表中極差R值可得四因素對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取率的影響大小順序：C>B>D>A;根據(jù)各個(gè)因素的均值K可以得出最佳工藝提取優(yōu)化組合為C3B1A3，即料液比1∶30（g/mL）、時(shí)間15 min、溫度35℃、浸提次數(shù)為2次。通過(guò)再次提取驗(yàn)證，球等金藻巖藻黃素的提取率為12.03 mg·g-1。

2.3?巖藻黃素分離純化結(jié)果分析

2.3.1?硅膠板薄層層析定性分析結(jié)果?通過(guò)薄層層析定性分析球等鞭金藻提取的巖藻黃素分離度，結(jié)果顯示層析液正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（3∶2∶1）對(duì)色素的分離度最好，能夠比較清晰地看出分離出3個(gè)條帶。所以選擇正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（3∶2∶1）混合液作為層析液。同時(shí)再進(jìn)一步調(diào)整正己烷、乙酸乙酯和甲醇的混合比率，來(lái)分離巖藻黃素。其結(jié)果顯示分離效果最好的混合比率是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（9∶2∶1）。正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（9∶2∶1）混合液層析分離效果好，能夠清楚地把球等鞭金藻提取的總色素里的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素c和巖藻黃素區(qū)分開(kāi)來(lái)。所以選用層析液正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇（9∶2∶1）作為進(jìn)一步硅膠柱層析分離純化巖藻黃素的洗脫液。

2.3.2?硅膠柱分離純化巖藻黃素結(jié)果?硅膠柱層析分離純化后收集的巖藻黃素溶液，再經(jīng)過(guò)40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至巖藻黃素粉末，再稱(chēng)重，甲醇溶解，取微量并稀釋適宜濃度通過(guò)UPLC檢測(cè)其濃度，再計(jì)算其含量和分離純化的純度。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到的總色素以濃縮至硅膠粉末的方法過(guò)柱純化后的回收率為67.03%，UPLC檢測(cè)計(jì)算其純度為23.94%，以濃縮液形式過(guò)柱分離純化后得到的回收率為86.35%，UPLC檢測(cè)計(jì)算純度為29.78%。通過(guò)這2種巖藻黃素濃縮方式過(guò)柱的回收率可以看出，巖藻黃素濃縮至硅膠粉末里巖藻黃素的損失比較大，以濃縮液方式過(guò)柱分離純化巖藻黃素?fù)p失較小，而且純度比較大。再將硅膠柱分離純化后的巖藻黃素經(jīng)硅膠薄層層析板定性分析，硅膠薄層層析板上只有單一的巖藻黃素條帶，說(shuō)明巖藻黃素純度還是比較高的。

2.4?巖藻黃素的LCMS定性結(jié)果分析

通過(guò)Thermo ScientificTM LCQ FleetTM LCMS質(zhì)譜儀檢測(cè)鑒定，檢測(cè)的巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品如圖6所示，出峰時(shí)間基本一致，沒(méi)有較大的雜峰，說(shuō)明巖藻黃素標(biāo)品純度高。巖藻黃素標(biāo)品質(zhì)譜圖如圖7所示，第一個(gè)大峰的峰面積是682.04，它是一個(gè)巖藻黃素分子量加上一個(gè)Na的分子量之和。巖藻黃素分子量為658.91，分子式為C42H58O6 ，Na的分子量為22.9898。計(jì)算可得巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子量為659.0502，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

經(jīng)過(guò)硅膠柱層析分離純化后的巖藻黃素檢測(cè)結(jié)果如圖8、9所示，出峰時(shí)間基本一致，沒(méi)有較多雜峰，說(shuō)明硅膠柱分離純化的結(jié)果較好，純度相對(duì)比較高。其質(zhì)譜圖顯示的分子量大小于巖藻黃素標(biāo)品一致，第一個(gè)大峰的峰面積是682.08，是一個(gè)巖藻黃素分子量加上一個(gè)Na的分子量之和。計(jì)算可得球等鞭金藻巖藻黃素純化后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小為659.0902，與巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本一致，與文獻(xiàn)報(bào)道的相符。

3?結(jié)論與討論

本研究以球等鞭金藻藻粉為原料，研究了球等鞭金藻中巖藻黃素有機(jī)溶劑提取的最佳工藝參數(shù)和硅膠層析柱分離純化。通過(guò)不同有機(jī)溶劑提取球等鞭金藻巖藻黃素的提取率試驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)了有機(jī)溶劑丙酮對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素的提取率最高，其次是甲醇?？紤]到丙酮屬于易制毒易制爆危險(xiǎn)品，毒性大，易致癌，易揮發(fā)，對(duì)人體危害大，不適合作為工廠(chǎng)化提取球等鞭金藻巖藻黃素的有機(jī)溶劑，所以選用了甲醇作為最適提取溶劑。對(duì)球等鞭金藻巖藻黃素提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)的提取率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了提高提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，其提取率就越高。有機(jī)溶劑浸提球等鞭金藻巖藻黃素作為工廠(chǎng)化應(yīng)用的發(fā)展方向，對(duì)3個(gè)主要提取條件進(jìn)行了正交工藝優(yōu)化，其結(jié)果顯示提取溫度在35℃、提取的料液比為1∶30、提取時(shí)間在15 min、提取次數(shù)在2次為最佳的提取工藝組合，通過(guò)再次提取驗(yàn)證，球等鞭金藻巖藻黃素的提取率為12.03 mg·g-1。

將球等鞭金藻提取的巖藻黃素經(jīng)過(guò)硅膠板薄層層析定性分析，選定層析液正己烷：乙酸乙酯：甲醇（9∶2∶1）作為硅膠柱進(jìn)一步分離純化的洗脫液，經(jīng)過(guò)硅膠柱分離純化得到了以總色素濃縮至硅膠粉末的方法過(guò)柱純化的回收率為67.03%，純度為23.94%;以濃縮液的形式過(guò)柱分離純化得到的回收率為86.35%，純度29.78%。通過(guò)這兩種巖藻黃素濃縮方式過(guò)柱的回收率可以看出，巖藻黃素濃縮至硅膠粉末里巖藻黃素的損失比較大，以濃縮液方式過(guò)柱分離純化巖藻黃素?fù)p失較小，而且純度比較大，硅膠柱分離純化后的巖藻黃素經(jīng)硅膠薄層層析板定性分析，硅膠薄層層析板上只有單一的巖藻黃素條帶，說(shuō)明巖藻黃素純度比較高。再通過(guò)Thermo ScientificTM LCQ FleetTM LCMS質(zhì)譜儀對(duì)巖藻黃素的定性檢測(cè)分析，球等鞭金藻里確實(shí)存在巖藻黃素，其巖藻黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小為659.0902，與文獻(xiàn)報(bào)道的相符。

本研究主要通過(guò)有機(jī)溶劑浸提法對(duì)球等鞭金藻中巖藻黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化和硅膠柱層析技術(shù)分離純化，為后續(xù)工業(yè)化快速提取球等鞭金藻中的巖藻黃素活性物質(zhì)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。但還存在很多不足，如：在提取過(guò)程可以引入超聲波輔助提取，在純化過(guò)程可以一級(jí)純化二級(jí)純化，可能純化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)更加的理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]臧正蓉.富含巖藻黃素的微藻藻種的篩選及其中試培養(yǎng)[D].北京：中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所），2014.

[2]劉春鳳，吳雪，高悅勉.兩種等鞭金藻外部形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)的觀察比較[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008（4）：273-277.

[3]王帥.富油微藻篩選及球等鞭金藻（Isochrysis galbana）脂肪酸去飽和酶基因的克隆與功能研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015.

[4]汪曙暉，薛長(zhǎng)湖.巖藻黃素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：408-410，407.

[5]張文源，高保燕，雷學(xué)青，等.巖藻黃素的理化與生物學(xué)特性、制備技術(shù)及其生理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)海洋藥物，2015，34（3）：81-95.

[6]周衛(wèi)松.裙帶菜中巖藻黃質(zhì)、巖藻多糖的綜合提取純化研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

[7]ZHANG Y P，F(xiàn)ANG H，XIE Q L，et al.Comparative Evaluation of the Radical?Scavenging Activities of Fucoxanthin and Its Stereoisomers[J].Molecules，2014，19：2100-2113.

[8]汪曙暉.海藻中巖藻黃素的分離鑒定及抗腫瘤活性研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

[9]XIA S，WANG K，WAN L，et al.Production， Characterization， and Antioxidant Activity of Fucoxanthin from the Marine Diatom Odontella aurita[J].Marine Drugs，2013，11（7）：2667.

[10]NISHINO H.Cancer prevention by carotenoids[J].Archives of Biochemistry & Biophysics，1998，402（1-2）：159-163.

[11]SUGAWARA T，BASKARAN V W，NAGAO A.Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed to fucoxanthinol during absorption by Caco?2 human intestinal cells and mice[J].Journal of Nutrition，2002，132（5）：946-951.

[12]HOSOKAWA M，KUDO M，MAEDA H，et al.Fucoxanthin induces apoptosis and enhances the antiproliferative effect of the PPARγ ligand，troglitazone，on colon cancer cells[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects，2004，1675（3）：113-119.

[13]KIM J C.Solvent Extraction of Fucoxanthin from Phaeodactylum tricornutum[J].Separation Science & Technology，2014，49（3）：410-415.

[14]WANG W J，WANG G C，ZHANG M，et al.Isolation of Fucoxanthin from the Rhizoid of Laminaria japonica Aresch[J].Journal of Integrative，2005，47（8）：1009-1015.

[15]尹尚軍，徐濤，劉麗平，等.羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2011（4）：272-275.

[16]ROH M K，CHUN U B S.Extraction of fucoxanthin and polyphenol from Undaria pinnatifida using supercritical carbon dioxide with co?solvent[J].Biotechnology & Bioprocess Engineering，2008，13（6）：724-729.

[17]XIAO X，SI X，YUAN Z，et al.Isolation of fucoxanthin from edible brown algae by microwave?assisted extraction coupled with high?speed countercurrent chromatography[J].Journal of Separation Science，2012，35（17）：2313-2317.

[18]陳文佳.海帶中巖藻黃素提取工藝優(yōu)化及性質(zhì)研究[D].濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012.

[19]MARCHAL L，LEGRAND J，F(xiàn)OUCAULT A.Centrifugal partition chromatography：A survey of its history，and our recent advances in the field[J].Chemical Record，2003，3（3）：133-143.

[20]PIOVAN A，F(xiàn)ILIPPINI R，DE P M，et al.TLC densitometric method for the preliminary evaluation of fucoxanthin?based products[J].Natural Product Research，2014，28（14）：1111-1115.

[21]RAJAURIA G，ABU?GHANNAM N.Isolation and Partial Characterization of Bioactive Fucoxanthin from Himanthalia elongata Brown Seaweed：A TLC?Based Approach[J].International Journal of Analytical Chemistry，2013，2013（1）：4518-4519.

[22]SUDHAKAR M P.Extraction， purification and study on antioxidant properties of fucoxanthin from brown seaweeds[J].Journal of Chemical & Pharmaceutical Research，2013，5（7）：169-175.

[23]HOSOKAWA M，WANEZAKI S，MIYAUCHI K，et al.Apoptosis?Inducing Effect of Fucoxanthin on Human Leukemia Cell Line HL60[J].Food Science & Technology Research，2006，5（3）：243-246.

（責(zé)任編輯：柯文輝）