枇杷果實中NAD MDH基因克隆及植物表達載體構(gòu)建

寇燕 楊俊 高歡歡 陳旭 郭傲 鄭國華

摘?要：為探索枇杷果實中蘋果酸的積累與降解機制，從枇杷果實轉(zhuǎn)錄組中得到NAD?MDH的開放閱讀框的基因序列。以枇杷高酸品種解放鐘和低酸品種白梨為材料，提取果實中總RNA，運用RT?PCR技術(shù)克隆出枇杷果實中蘋果酸合成酶基因NAD?MDH，并進行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明：枇杷果實中蘋果酸合成酶基因NAD?MDH的開放閱讀框（ORF）為996 bp，共編碼了332個氨基酸。經(jīng)熒光定量PCR分析，解放鐘和白梨在花期后95 d時NAD?MDH基因表達量最高;花后80～105 d，NAD?MDH基因在高酸與低酸品種間存在顯著差異。采用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建了植物表達載體EjNAD?MDH?PBI121，并導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中得到植物轉(zhuǎn)化工程菌，為后期利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良枇杷果實品質(zhì)及遺傳改良打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枇杷;NAD?MDH基因;基因克隆;表達分析;載體構(gòu)建

中圖分類號：S667.3?文獻標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）04-0001-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.001

Cloning of NAD?MDH Gene in Loquat Fruit and the Construction of Plant Expression Vector-

KOU Yan， YANG Jun， GAO Huan?huan， CHEN Xu， GUO Ao， ZHENG Guo?hua*

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Storage Science and Technology ofHorticultural Products， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： In order to explore the accumulation and degradation mechanism of malic acid in loquat fruit， the gene sequence of the open reading frame of NAD?MDH was obtained from the transcriptome of loquat fruit. By taking Jiefangzhong （the high?acid variety of loquat） and Baili （the low?acid variety of loquat） as the materials， the total RNA was extracted from the fruit， and the NAD?MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was cloned by RT?PCR， and then the fluorogenic quantitative PCR analysis was conducted. The results showed that the open reading frame （ORF） of the NAD?MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was 996 bp， encoding 332 amino acids. The fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene expression of NAD?MDH was the highest in Jiefangzhong and Baili at 95 d after flowering， while the NAD?MDH gene showed significant difference between the high?acid and low?acid varieties at 80-105 d after flowering. The plant expression vector EjNAD?MDH?PBI121 was successfully constructed by the seamless cloning technology， and then was introduced into the agrobacterium tumefaciens EHA105 to obtain the engineering bacteria for plant transformation， which laid a foundation for the later use of transgenic technology to improve the quality and genetic improvement of loquat fruit.

Key words： Loquat; NADMDH gene; Gene cloning; Expression analysis; Vector construction

枇杷是我國的原產(chǎn)果樹，其產(chǎn)量、面積均居世界第一[1]。枇杷果肉柔軟多汁，風(fēng)味獨特，并且具有潤肺、 止渴等作用，一直以來都深受人們喜愛。枇杷果實成熟時期在春末夏初，此時正值水果淡季，因此具有較強的市場競爭力[2]。枇杷果實酸度偏高是影響其效益的主要問題，果實中有機酸的種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響果實品質(zhì)的重要因素之一[3]。根據(jù)水果果實在成熟過程中有機酸的積累可以分為3種類型：檸檬酸型、蘋果酸型、酒石酸型，枇杷果實屬于蘋果酸型的水果[4]。雖然枇杷果實中調(diào)控酸性的性狀基因是一對主效基因（Ma/ma），但其果實中蘋果酸的積累還需要通過蘋果酸代謝來實現(xiàn)，cyNAD?MDH基因是調(diào)控蘋果酸合成途徑的關(guān)鍵基因[5]。王鵬飛[6]從歐李果實的轉(zhuǎn)錄組中克隆出MDH基因，其研究結(jié)果表明MDH基因表達量差異是高低酸品種間蘋果酸積累差異的重要原因之一。姚玉新等

[7]克隆出蘋果果實中的cyMDH基因，并且通過原核表達鑒定其功能。任磊等[8]等已成功克隆得到牡丹的PsMDH基因，成功構(gòu)建正義植物表達載體。但對于枇杷果實中cyNAD?MDH基因的克隆及載體構(gòu)建仍然未見報道。本試驗采用RT?PCR技術(shù)克隆出NAD?MDH基因的ORF，并且通過生物信息學(xué)工具分析NAD?MDH基因的序列特征。利用qRT?PCR技術(shù)對枇杷高酸品種解放鐘和低酸品種白梨果實不同發(fā)育階段的表達量進行檢測，分析兩品種之間基因表達量的差異。采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建植物表達載體EjNAD?MDH?PBI121導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，獲得轉(zhuǎn)基因菌株，旨在為鑒定NAD?MDH基因的功能提供參考，同時也為進一步研究枇杷果實中調(diào)控蘋果酸代謝基因及遺傳改良提供基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料和試劑

供試枇杷果實采自莆田市常太鎮(zhèn)果園，枇杷樹為10年生，選取盛花期一致的解放鐘和白梨2個枇杷品種各3株，從幼果直至成熟，每隔2周采樣1次，每次兩個品種各采30個果實。采后迅速去皮用錫箔紙包好于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中以備提取RNA。

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒快速提取試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司;In?Fusion HD Cloning kits、Xba I和Sca I限制性內(nèi)切酶、PrimeScript TMRT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR○RPremix Ex TapTM購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;農(nóng)桿菌EHA105、大腸桿菌（Esherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞和HiFi酶、dNTP等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pBI121載體由本實驗室提供，所有引物由華大基因生物有限公司合成。

1.2?試驗方法

1.2.1?枇杷果實RNA提取和cDNA合成?嚴(yán)格按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書進行操作，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c檢測提取RNA質(zhì)量和濃度。以枇杷果實總RNA為模板，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser合成cDNA。

1.2.2?EjNAD?MDH基因克隆?根據(jù)已有枇杷RNA?seq數(shù)據(jù)庫篩選得到NAD?MDH基因保守區(qū)的核苷酸序列，設(shè)計NAD?MDH基因引物（表1），取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL為模板，建立25 μL如下PCR反應(yīng)體系：10×Ex?Taq Buffer 2.5 μL;dNTP Mixture（10 mmol·L-1）0.5 μL;上、下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL;cDNA模板，1 μL;Ex?Taq（5 U·μL-1），0.3 μL，加ddH2O至25 μL。按照如下擴增程序進行：94℃預(yù)變性5 min;循環(huán)35個（94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s）;72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接到pUCm?T載體上，用通用引物M13進行菌液PCR檢測，篩選正確的陽性克隆子送深圳華大基因生物有限公司測序。

1.2.3?果實發(fā)育過程中EjNAD?MDH基因的表達分析?以轉(zhuǎn)錄組中的Actin為內(nèi)參基因，分別設(shè)計內(nèi)參基因和目的基因熒光定量引物為Actin?F和Actin?R、QMDH?F和QMDH?R（表1），使用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取枇杷果實不同成熟期的RNA， 參照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA。實時定量 PCR 體系按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ試劑盒說明書進行，反應(yīng)參數(shù)為95℃30 s，1個循環(huán);95℃5 s，60℃20 s，45個循環(huán)，每個樣品設(shè)3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。以actin為內(nèi)參基因，對枇杷在不同發(fā)育時期的表達量進行分析。

1.2.4?生物信息學(xué)分析?使用DNAMAN軟件比對和拼接氨基酸序列;利用Pfam 26.0（http：//pfam.sanger.ac.uk）和NCBI中Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）程序進行蛋白保守域結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用PredictProtein在線軟件（http：//www.predictprotein.org/）進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用 SWISS?MODEL在線軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.5?NAD?MDH基因的植物表達載體構(gòu)建?采用 In?Fusion同源重組技術(shù)構(gòu)建植物表達載體。利用snapgene軟件在NAD?MDH基因的引物5′端添加與載體同源15 bp且含有酶切位點的上下游引物，引物序列見表1。分別使用Xba I和Sca I限制性內(nèi)切酶酶切pBI121質(zhì)粒，按照酶切體系：pBI121質(zhì)粒8 μL、Xba I 1 μL、Sca I 1 μL、10×buffer 2 μL、ddH2O 8 μL，混勻后37°酶切過夜，獲得含有Xba I和Sca I酶切位點的pBI121線性質(zhì)粒。使用質(zhì)?？焖?/p>

提取試劑盒提取對1.2.2中的菌液進行質(zhì)粒提取，以提取的質(zhì)粒為模板，使用帶有同源15 bp的引物對其進行擴增，PCR條件與程序同1.2.2，對目的基因片段進行膠回收。將帶有同源15 bp的NAD?MDH基因片段與載體線性片段進行連接體系：線性PCR產(chǎn)物3 μL、線性載體1 μL、5X In?Fusion HD Enzyme Premix 2 μL、ddH2O 4 μL。取2.5 μL的反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含有Kanna的LB板，37℃過夜培養(yǎng)，挑去單菌落進行PCR并送華大基因生物有限公司測序。

2?結(jié)果與分析

2.1?枇杷果肉總RNA的提取

枇杷果肉總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢驗其完整性，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，RNA條帶完整，18S和28S主條帶清晰，且無DNA的污染，表明提取的總RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄合成質(zhì)量較好的cDNA。

2.2?枇杷NAD?MDH基因的ORF克隆

以枇杷果實中的RNA為模板，設(shè)計1對引物MDH?F和MDH?R為上下游引物進行PCR擴增，獲得了與預(yù)期片段大小一致約996 bp條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物回收并進行連接轉(zhuǎn)化，挑取白色菌落進行PCR鑒定，將鑒定為陽性的3個克隆子送華大基因生物有限公司測序，測序結(jié)果表明克隆的EjNAD?MDH基因ORF為996 bp，編碼332個氨基酸（圖3），利用NCBI中Blast對序列進行同源檢索，表明此序列與其他已登陸的蘋果、李、梨的NAD?MDH基因同源性高達95%～100%，將該基

2.3?EjNAD?MDH基因編碼的蛋白質(zhì)的生物信息

利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）翻譯所得NAD?MDH基因序列，得到的結(jié)果為NAD?MDH基因共編碼332個氨基酸殘基，理論上的蛋白分子量35.61 kD，理論等電點為6.01，分子式為C1573H2533N433O478S14。其中，負(fù)電荷殘基數(shù)為36個，正電荷殘基數(shù)為32個，枇杷NAD?MDH蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為33.08（<40），屬于穩(wěn)定蛋白。EjNAD?MDH基因編碼蛋白的疏水性分析結(jié)果表明，疏水性最大值為1.800，最小值為-2.891，其大部分區(qū)域為親水區(qū)（圖4A）。采用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST對編碼蛋白結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，得出MDH基因與其家族基因具有很高的特征序列（圖4B），對于MDH蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測時采用了SOPMA程序，其結(jié)果表明NAD?MDH基因主要由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲四者組成，所占比例分別為45.18%、4.52%、16.87%和33.43%（圖4C）。采用swissmodel對NAD?MDH蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，表明與4mdhB模型相似度高達80%（圖4D）。

2.4?EjNAD?MDH蛋白質(zhì)的氨基酸同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

將NAD?MDH基因編碼的氨基酸提交到NCBI中的blast與薔薇科植物的NAD?MDH基因編碼的蛋白質(zhì)進行比對分析（圖5），結(jié)果表明枇杷NAD?MDH蛋白與薔薇科的植物蘋果、歐李、白梨等的同源性高達80%以上。在同源性的基礎(chǔ)上運用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖6），可以看出枇杷與蘋果、白梨、歐李、甜櫻桃等親緣關(guān)系較近，但與番茄和胡楊關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5?NAD?MDH基因植物表達載體的構(gòu)建

分別使用Xba I和Sca I限制性內(nèi)切酶酶切檢測正確的質(zhì)粒PBI121，產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳后表明酶切成功（圖7），回收PBI121的線性片段，按照In?Fusion試劑盒的操作說明將質(zhì)粒的線性片段與帶有同源15 bp的目的基因進行基因重組，對轉(zhuǎn)化后的菌液進行PCR檢驗，與預(yù)期結(jié)果一致，得到996 bp的片段（圖8），送華大基因生物有限公司進行檢測，結(jié)果序列正確，表明載體EjNAD?MDH??PBI121構(gòu)建成功。

2.6?NAD?MDH基因的定量表達分析

利用熒光定量對枇杷果實生長發(fā)育過程中的NAD?MDH基因進行定量分析，由圖9可知，解放鐘和白梨果實中NAD?MDH基因表達量有著相似的趨勢，均呈現(xiàn)先升高降低再升高降低的趨勢。解放鐘NAD?MDH基因的表達量較白梨的波動趨勢大，兩者都呈現(xiàn)鋸齒狀波動。在盛花期后95 d NAD?MDH基因在兩個枇杷品種中的表達量最高，分別為7.14和3.82;在花后80 d之后解放鐘NAD?MDH的表達量明顯高于白梨的表達量。

3?討論

植物細(xì)胞中含有多種類型的蘋果酸合成酶如NAD?MDH和NADP?MDH等，其中NAD?MDH主要參與三羧酸循環(huán)，是蘋果酸代謝過程中合成蘋果酸的關(guān)鍵酶之一[9]。近年來，前人對薔薇科果樹的MDH基因進行了廣泛的研究。Yao等[10]從蘋果果實克隆了cyMDH基因的全長，其保守序列996 bp，編碼了332個氨基酸，并且通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證了MdMDH與蘋果酸的合成有著密切的聯(lián)系。田麗[11]從郁李的果實中分離克隆出NAD?MDH基因的保守序列872 bp，與蘋果、桃的MDH基因相似性為98%和95%。本研究從枇杷果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出EjNAD?MDH家族中表達量較高的EjNAD?MDH基因，運用RT?PCR技術(shù)克隆EjNAD?MDH基因的保守區(qū)序列長度為996 bp，編碼了332個氨基酸，蛋白分子量為35.61 kD，理論等電點為6.01，分子式為C1573H2533N433O478S14。EjNAD?MDH蛋白屬于親水性蛋白。通過進化樹分析，EjNAD?MDH基因與其他物種的同源性很高，表明EjNAD?MDH基因在進化上具有高度的保守性[12]。

利用熒光定量PCR對2個枇杷果實的NAD?MDH基因在發(fā)育階段的表達進行檢測，采用Livak等[13]的2-ΔΔCT的方法對結(jié)果進行分析，結(jié)果表明高酸和低酸枇杷品種的NAD?MDH基因表達量具有相似的波動趨勢，兩個品種在花后（即果實成熟前）50～80 d時NAD?MDH基因的表達量很低，花后95 d（即果實成熟時）兩個品種的基因表達量達到最高，果實成熟后表達量降低但波動趨勢小。高酸（解放鐘）枇杷的NAD?MDH基因在果實發(fā)育過程中的表達量與低酸（白梨）枇杷的表達量存在顯著差異，表明NAD?MDH基因在兩個品種酸度差異中起到重要的調(diào)控作用。

將分離克隆的目的基因轉(zhuǎn)化到宿主基因組中，是基因工程的一項基本技術(shù)。植物表達載體是將目的基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重要媒介，載體構(gòu)建是通過遺傳轉(zhuǎn)化方法開展基因功能鑒定的重要環(huán)節(jié)[14]。分析不同載體構(gòu)建的方法，表明現(xiàn)在的主流構(gòu)建載體的方式是Gateway技術(shù)，預(yù)測未來載體構(gòu)建的發(fā)展趨勢將是無酶連接[15-19]。韓凱等[19]對傳統(tǒng)的構(gòu)建方法、Gateway和采用無縫克隆構(gòu)建載體的技術(shù)進行分析，從操作步驟、成本和時間等多方面進行綜合比較，表明采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建的方法具有更高的優(yōu)勢。本研究使用無縫克隆技術(shù)[20]，成功構(gòu)建了EjNAD?MDH?PBI121表達載體，并采用凍溶法將表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。下一步將攜帶EjNAD?MDH?PBI121的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入番茄等作物，為進一步研究EjNAD?MDH基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）